【摘要】： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.Pylori)是定植在人胃粘膜上革蘭染色陰性的微需氧菌,其感染是誘發(fā)人胃粘膜病變的主要因素之一,在世界范圍內(nèi)約有50%人群感染H.Pylori。世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌源,但其與胃癌發(fā)生機制尚未完全明確。 PUMA(P53正向細胞凋亡調(diào)控因子)是新近發(fā)現(xiàn)的bcl-2家族BH-3亞家族中的促凋亡成員,在p53依賴和非依賴途徑的細胞凋亡啟動與腫瘤發(fā)生過程中都發(fā)揮著重要作用。該基因定位于19q,cDNA全長1.9 kb,編碼一個全長為193個氨基酸殘基的蛋白。PUMA基因具有4個外顯子(1a或1b,2,3,4)和三個內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄后形成四種不同的剪接體(PUMA-α,-β,-γ及-δ)。目前PUMA四種剪接體在腫瘤細胞中的表達分布及功能尚不清楚。 本論文的目的是研究PUMA基因四種剪接體在胃癌組織及細胞中的表達特點,以及不同H.Pylori菌株(潰瘍及胃癌菌株)對胃癌細胞(BGC-823)及人正常胃上皮細胞(GES-1)中PUMA基因四種剪接體表達變化的影響,并初步探討H.Pylori對PUMA基因的作用機制以及與胃癌發(fā)生的關(guān)系。 方法:1.利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測胃癌組織、癌旁組織及不同胃癌細胞系BGC-823和SGC-7901細胞中四種剪接體的mRNA表達水平,對PCR產(chǎn)物進行克隆和測序分析。2.從人胃粘膜組織中分離不同的幽門螺桿菌菌株,分別與BGC-823或GES-1細胞共培養(yǎng),提取細胞總RNA,在不同時間點測定PUMA基因四種剪接體表達的變化。3.MTT法分析H.Pylori刺激后細胞增殖抑制情況。4.應(yīng)用JC-1熒光染料法檢測不同H.Pylori菌株刺激BGC-823或GES-1細胞后線粒體膜電位的變化。5.同時,采用熒光定量PCR法檢測p53基因表達的變化,探討與PUMA四種剪接體在H.Pylori刺激后表達變化的相關(guān)性。 結(jié)果:1.PUMA四種剪接體經(jīng)PCR擴增,并進行克隆測序后與GenBank中序列進行同源性比較,證實為PUMA-α,-β,-γ,及-δ,同源性均在99%以上。PUMA-α和-β在癌旁組織中表達陽性,但在癌組織中表達難以檢測,差異顯著(P＜0.05);PUMA-γ和-δ在癌旁及癌組織中均可見表達,且在癌旁組織中的表達量顯著高于癌組織(P＜0.05)。PUMA-α,-γ及-δ在胃癌不同分化程度的細胞系BGC-823(低分化)及SGC-7901(中分化)中均有表達,但兩細胞系間無統(tǒng)計學(xué)差異。而PUMA-β在BGC-823中的表達明顯高于SGC-7901細胞(P＜0.05)。2.兩種H.Pylori菌株刺激BGC-823細胞后與未刺激組相比,3個時間點(3 h、6 h及9 h)PUMA剪接體mRNA相對表達量均下調(diào)(P＜0.05),但四種剪接體表達變化各有特點:PUMA-β在兩種H.Pylori菌株刺激后mRNA都難以檢測到;在潰瘍菌株刺激組,PUMA-α在6 h時下調(diào)最顯著,-γ在3個時間點表達量降低的百分比無明顯差別;而-δ在9 h時下調(diào)較明顯。而在胃癌菌株刺激組,-α在3 h,-γ在3 h、6 h,-δ在9 h未檢測到表達。3.兩種H.Pylori菌株刺激GES-1細胞后結(jié)果顯示:潰瘍型刺激后PUMA剪接體在初期表達上調(diào),9 h時表達又下調(diào)。而胃癌型的H.Pylori作用于GES-1細胞后發(fā)現(xiàn):與對照組相比,在3 h時PUMA剪接體表達下調(diào),而6 h,9h時又有恢復(fù)趨勢。4.MTT法檢測H.Pylori刺激前后BGC-823或GES-1細胞增殖抑制情況顯示兩種菌株對BGC-823細胞均有增殖作用;而對于GES-1細胞而言,潰瘍菌株先誘導(dǎo)凋亡后又促進增殖。胃癌菌株則促進GES-1細胞增殖。5.JC-1熒光染色法檢測提示兩種菌株對BGC-823或GES-1細胞均促進增殖。6.熒光定量PCR結(jié)果顯示與未刺激組相比,不同H.Pylori菌株刺激BGC-823細胞9 h后p53基因表達均顯著性上調(diào)(P＜0.01),而3 h,6 h時卻無明顯變化;兩種菌株刺激GES-1細胞后與未刺激組相比,p53基因在3個時間點表達都上調(diào)(P＜0.05),且有較好的時效關(guān)系(r_(潰瘍型)=-0.978,r_(胃癌型)=0.943,P＜0.01)。 結(jié)論:1.PUMA四種剪接體在胃癌組織中的表達下調(diào),與癌的發(fā)生呈負相關(guān);PUMA-β的表達還可能與細胞的分化程度有關(guān)。2.在BGC-823細胞中,H.Pylori可促進細胞增殖,并顯著下調(diào)PUMA剪接體的表達,這種下調(diào)作用與p53無關(guān)。PUMA的表達與細胞增殖負相關(guān)。3.潰瘍型H.Pylori對GES-1細胞先誘導(dǎo)凋亡后又促進增殖;PUMA剪接體的變化與細胞增殖變化一致;p53在刺激早期表達迅速上調(diào),之后表達逐漸下降,與PUMA具相似的趨勢,提示在胃上皮細胞中PUMA的表達可能依賴于p53的表達水平。4.胃癌型H.Bylori對GES-1細胞具有促增殖作用;對PUMA的表達先抑制后又恢復(fù),而對p53的表達則有促進作用。在胃上皮細胞中,胃癌型H.Pylori對PUMA剪接體的作用可能與p53有關(guān)。綜上所述,不同類型H.pylori對細胞的刺激所產(chǎn)生的效果不一致,胃癌型H.pylori促進細胞增殖的作用更明顯。
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【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2402636