【摘要】：自上世紀六、七十年代Altman首次報道成年哺乳動物腦內存在神經(jīng)再生(neurogenesis)以來,人們通過大量的實驗研究發(fā)現(xiàn),在成年鳥類、嚙齒類、狨猴甚至人類的腦內存在有一種僅具有分化為神經(jīng)元和膠質細胞潛能的神經(jīng)前體細胞(neuroprogenitors),它終生能夠生成新的神經(jīng)元以適應某些生理(如學習、遷徙、應激、幼仔識別)或病理(如腦缺血、抑郁癥、精神分裂癥、癲癇等)反應。這個現(xiàn)象稱為成年腦神經(jīng)再生。成年腦神經(jīng)再生主要發(fā)生在兩個腦區(qū):側腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回顆粒細胞下層區(qū)(subgranular zone,SGZ),通稱為結構性神經(jīng)元發(fā)生區(qū);每天SVZ區(qū)約有30,000個新生細胞沿RMS通路向嗅球遷移,生成中間神經(jīng)元;而SGZ區(qū)約有9,000個新生細胞向顆粒細胞層遷移,生成顆粒細胞。近些年研究還發(fā)現(xiàn),腦內還存在一些區(qū)域,如紋狀體、皮層、海馬CA1區(qū)錐體細胞層(通常被稱為非神經(jīng)元發(fā)生區(qū)),它們在生理條件下不存在神經(jīng)再生,但在腦卒中等病理條件下,這些腦區(qū)也可發(fā)生神經(jīng)再生。就其過程而言,成年腦神經(jīng)再生包括神經(jīng)前體細胞的增殖、遷移、分化、成熟、存活和建立突觸環(huán)路等多個環(huán)節(jié);促進神經(jīng)再生的因素可通過這些不同的環(huán)節(jié)來調控成年腦神經(jīng)再生。近些年來的研究成果表明,成年腦神經(jīng)再生的研究可能為腦卒中等腦損傷疾病以及抑郁癥等精神疾病的治療帶來新的希望。但目前對這些神經(jīng)前體細胞的生物學特性的認識以及對成年腦神經(jīng)再生的細胞和分子機制還不清楚? 甘氨酸受體是五聚體型配體門控的Cl~-通道,為α亞基組成的同聚體或2α:3β組成的異聚體,其中α亞基有四種亞型(α1-α4),β亞基只有一種亞型,研究表明這些亞型的結構存在著高度的序列同源性。但,有趣的是,甘氨酸受體的組成及其亞型分布隨著個體發(fā)育階段的不同而發(fā)生著變化:新生個體的甘氨酸受體通常是由α2組成的同五聚體,主要存在突觸外;成熟個體的甘氨酸受體是由α1和β組成的異五聚體,主要存在突觸內。α2亞基在出生前的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達,出生后表達水平逐漸下降,成年后僅在海馬和丘腦等腦組織中有表達。這些研究表明,甘氨酸受體α2亞型可能與細胞的發(fā)育相關。 近年來,有大量的研究表明,甘氨酸受體的α2亞型在神經(jīng)元的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。1998年Flint等報道從未成熟的皮層神經(jīng)元釋放的Taurine通過作用于突觸外甘氨酸受體,可影響皮層的發(fā)育,皮層的重量和形態(tài)都發(fā)生了改變。2004年Young和Cepko敲除視網(wǎng)膜的甘氨酸受體α2亞基,從而減少了神經(jīng)前體細胞向視桿細胞的分化。2006年Pierre Drapeau靶向性的敲除斑馬魚胚胎的甘氨酸受體α2亞基,破壞了其運動節(jié)律的形成,采用免疫組織化學的方法發(fā)現(xiàn)是由于脊髓中間神經(jīng)元的數(shù)目減少了。這些研究結果表明突觸外甘氨酸受體可以調控神經(jīng)元的發(fā)育。我們以往的研究結果也表明,成年神經(jīng)前體細胞表達甘氨酸受體α2亞基;甘氨酸受體的阻斷劑士的寧能夠減少海馬SGZ區(qū)新生細胞的數(shù)目,而激動劑能夠增加SGZ區(qū)新生細胞的數(shù)目,提示甘氨酸受體可能參與了成年神經(jīng)前體細胞的調控。本研究的目的是在培養(yǎng)的成年神經(jīng)前體細胞上進一步證明甘氨酸受體對成年神經(jīng)前體細胞的調控作用及其可能的機制。 研究成年神經(jīng)前體細胞的調控機制,最重要的一個前題條件就是建立成年神經(jīng)前體細胞的體外培養(yǎng)技術平臺,但成年大鼠神經(jīng)前體細胞的體外培養(yǎng)一直都是一件比較棘手的事情。目前國際上主要有兩種培養(yǎng)方法:懸浮法和貼壁法。Gage FH小組的貼壁培養(yǎng)法已被國際同行廣泛認可。 本研究的主要目的是:1、建立成年神經(jīng)前體細胞的體外培養(yǎng)體系,并鑒定其純度;2、研究甘氨酸受體各亞基在成年神經(jīng)前體細胞上的表達,尤其是α2亞基的表達情況;3、研究甘氨酸受體的阻斷劑士的寧(Strychnine)、印防己毒素(Picrotoxin)和激動劑�；撬�(Taurine)對成年神經(jīng)前體細胞增殖的影響,探討甘氨酸受體α2亞型對成年神經(jīng)前體細胞的調控作用。 本實驗培養(yǎng)的成年神經(jīng)前體細胞,利用無血清培養(yǎng)技術,在添加堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的rat neural stem cell expansion medium培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn),成年神經(jīng)前體細胞體積較小,呈圓形,周圍長有細小突起。采用細胞免疫熒光法對培養(yǎng)的成年神經(jīng)前體細胞進行鑒定,呈巢蛋白(nestin)陽性的細胞高達99%。 甘氨酸受體各亞基的表達情況:采用細胞免疫熒光標記技術和RT-PCR方法,證明了培養(yǎng)的成年神經(jīng)前體細胞上僅表達甘氨酸受體α2亞基,不表達α1和α3亞基。 甘氨酸受體對成年神經(jīng)前體細胞調控作用的研究:把單細胞懸液接種于經(jīng)PLL包被的培養(yǎng)板上,加入不同濃度的Strychnine、Picrotoxin、Taurine處理46小時,再加入5umol/L的BrdU作用2小時后,采用BrdU免疫熒光標記技術標記分裂的細胞,計數(shù)BrdU/DAPI雙陽性細胞的數(shù)目。2.5uM Strychnine組、5uMStrychnine組、10uM Strychnine組、20uM Strychnine組BrdU陽性細胞數(shù)的比例分別為control組的88.75%、86.66%、81.63%、80.39%,其中5、10、20uM Strychnine組與control組比較有統(tǒng)計學意義。5uM Picrotoxin組、10uM Picrotoxin組、20uMPicrotoxin組、40uM Picrotoxin組BrdU陽性細胞數(shù)的比例分別為control組的104.32%、88.2%、73.77%、66.84%,其中10、20、40 uM Picrotoxin組與control組相比有統(tǒng)計學意義。200uM Taurine組、600uM Taurine組、1mM Taurine組BrdU陽性細胞數(shù)的比例分別為control組的98.21%、92.97%、100.3%,各組與control組相比均沒有統(tǒng)計學意義。結果顯示Strychnine、Picrotoxin可抑制成年神經(jīng)前體細胞的增殖,且呈濃度依賴性。 以上實驗結果表明,培養(yǎng)的成年神經(jīng)前體細胞上表達有甘氨酸受體α2亞基,且甘氨酸受體的阻斷劑Strychnine、Picrotoxin可以抑制成年神經(jīng)前體細胞的分裂增殖,提示甘氨酸受體α2亞型可能參與成年神經(jīng)前體細胞增殖的調控。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2400271