【摘要】： 研究背景: 人口老齡化是二十一世紀人類發(fā)展的主要特征,在我國尤其明顯。根據新公布的國家人口發(fā)展戰(zhàn)略研究報告表明,二十世紀末,我國60歲以上老年人口占總人口的比例超過10%;2005年底,我國60歲以上老年人口近1.44億,占總人口的比例達11%;當前,我國老年人口正以年均約3%的速度增長,并將以每10年純增1億老年人口的速度加速老齡化進程。隨著老年人口的增多,我國老年人疾病譜也由相對分散向相對集中轉變,發(fā)病率前五位是高血壓、冠心病、腦血管病、糖尿病、腫瘤。其中以腦老化為表現的疾病在老年人群中的高發(fā)病率使其成為威脅老年人健康的重要疾病。因此急需開展腦老化發(fā)病機制及防治對策的研究。 腦老化發(fā)生的傳統(tǒng)危險因素包括年齡、高血壓、高血脂、吸煙、高血糖、以及性別等,以往一直認為年齡屬于腦老化不可改變的危險因素,因此研究相對較少。隨著人口老齡化的日益發(fā)展,有關年齡在腦老化發(fā)生發(fā)展機制的研究逐漸引起重視,并成為防治腦老化的新靶點。流行病學研究表明年齡是腦老化發(fā)生與發(fā)展的獨立的危險因素,隨著年齡的增加,促使腦老化的發(fā)生率顯著升高的一個最具有老年人特點的原因是腦組織隨增齡發(fā)生了變化,部分腦細胞發(fā)生了衰老,表現為腦重量的下降、腦神經細胞數量減少及腦細胞中出現老年色素等�，F在越來越多的研究表明腦老化狀態(tài)下的腦細胞處于衰老狀態(tài),腦細胞的衰老是腦老化的重要原因這一觀點已被廣泛認同。研究發(fā)現,作為高級神經內分泌中樞的下丘腦是腦老化過程中較先出現老化的部位,提示下丘腦可能在衰老發(fā)展中起重要作用�，F在不少老年醫(yī)學的專家建議將抗衰老治療當作治療腦老化的一項新的治療策略。那么隨著增齡腦組織為什么會發(fā)生這些變化,腦細胞為什么會衰老,隱藏在腦老化后的細胞和分子水平的衰老機制是什么?這種機制是否可為改善或者延緩腦老化提供重要思路?在人口老齡化日益發(fā)展的現狀下,這已成為腦老化防治急需回答的關鍵問題之一。 在增齡過程中,另一個顯著變化是性激素平衡的改變。睪酮是男性體內最重要的雄激素,屬于一種合成激素,研究發(fā)現,男性50歲后體內總睪酮及生物活性睪酮水平逐漸出現明顯下降。老年男性血漿睪酮水平與多種增齡相關性疾病發(fā)病率呈負相關。多項睪酮替代治療的臨床試驗發(fā)現,睪酮可改善老年人認知能力、調整肌肉脂肪比例,加強肌肉力量,增強運動能力,抑制血脂異常。減少胰島素抵抗,改善性功能等等,但睪酮能否改善老年男性的下丘腦功能,延緩老年性腦老化的發(fā)生,文獻未見報道。我們之前的研究表明,睪酮在體外干預血管內皮細胞可抑制過氧化氫誘導的內皮細胞衰老,但對下丘腦函待研究。 生物衰老的各種變化,不僅表現在宏觀上,更主要的是表現在微觀上。衰老機制的研究,現在已經從整體水平、器官水平發(fā)展到細胞水平、分子水平。隨著細胞生物學、分子生物學等學科的迅速發(fā)展,目前國內外對衰老機制開展的多方面研究都有很大的進展,并提出若干具有較高水平的衰老學說,有自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說、生物膜損害學說、遺傳程序學說、染色體突變學說、差錯學說、免疫學說、內分泌學說等�？傮w來講上述這些學說可分為兩大類:即一類為以ROS、糖基化、激素紊亂等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論,認為衰老是環(huán)境因素對細胞進行性和累積性毀壞的結果,另一類是以端�？s短、細胞周期調控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論,認為衰老是機體有序的基因活動,是通過遺傳按程序預先安排好的,或為特異的“衰老”基因所表達,或為可用基因的最終耗竭。這些學說從不同學科角度出發(fā),對衰老機制進行了較為深入的探索,目前正逐漸向更深層次的研究方向發(fā)展,并已經逐漸走進了將上述兩大理論進行合作的時代,即將研究集中在環(huán)境因子傷害造成衰老的遺傳程序改變的相關范圍之內。 D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠模型是目前常采用的衰老模型,在一定時間內通過皮下連續(xù)注射D-半乳糖,使機體細胞內半乳糖濃度增高,在醛糖還原酶催化下,還原成半乳糖醇,該物質不能在細胞內進一步代謝而堆積,影響細胞正常滲透壓,導致細胞代謝紊亂,ROS堆積。D-半乳糖在體內可形成晚期糖基化終產物(AGE),AGE可加強ROS損傷并引起微管相關蛋白(Tau)異常磷酸化及細胞骨架微絲集結,參與了D-半乳糖誘導小鼠衰老過程,非酶性糖化作用也是促進ROS致腦衰老的途徑之一。腦內ROS的堆積是否參與了腦老化的形成,其作用機制如何?目前尚不明確。 研究目的: 本研究用睪酮干預D-半乳糖誘導的小鼠模型,通過對下丘腦組織切片形態(tài)結構的觀察和SA-β-半乳糖苷酶活性的測定,探討連續(xù)5個月皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg.d的小鼠下丘腦是否發(fā)生衰老及睪酮對下丘腦衰老是否具有干預作用;并且通過測定細胞周期調控因子p16~(INK4a)的表達變化來探討下丘腦衰老的機制以及睪酮干預的可能途徑。 方法: 1、實驗小鼠分組及模型的建立 將SPF級8-12周齡24只C57雄性健康小鼠隨機分為3組,每組各8只: (1)D-半乳糖組:背部皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg.d,用藥5個月; (2)睪酮干預組:在D-半乳糖組基礎上,背部皮下注射十一酸睪酮5mg/kg.2w,用藥5個月; (3)正常對照組:背部皮下注射相等劑量生理鹽水,1次/d,用藥5個月。 2、模型建立后,觀察各組小鼠一般情況(觸須、體型等方面)及體重。 3、小鼠腦組織的分離和下丘腦組織切片的制作。 4、用HE染色法觀察各組小鼠下丘腦組織切片的染色情況。 5、用SA-β-半乳糖苷酶染色法測定各組小鼠下丘腦染色陽性細胞百分比。 6、用免疫組化法測定各組小鼠下丘腦p16~(INK4a)蛋白表達陽性細胞率。 統(tǒng)計分析: 實驗數據用SPSS13.0軟件分析。所得數據均以(?)±s表示。各組間數據比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P0.05(雙側)為差異有統(tǒng)計學意義。 結果: 1.各組小鼠一般情況及體重: 模型建立后,D-半乳糖組小鼠普遍出現觸須脫落、弓背、豎毛、行動遲緩等體征,而正常對照組小鼠觸須完整,行動敏捷,無弓背、豎毛現象。睪酮干預組小鼠亦未出現觸須脫落、弓背、豎毛、行動遲緩等體征。與正常對照組比較,D-半乳糖組小鼠體重明顯降低,差異有顯著性(P0.05);與D-半乳糖組比較,睪酮干預組小鼠體重明顯升高,差異有顯著性(P0.05),但仍低于正常對照組(P0.05)。 2.各組小鼠下丘腦HE染色情況 在400倍鏡下觀察,正常對照組可見細胞結構清楚,神經元細胞數目多,細胞排列規(guī)整,核深染,核膜清晰,核仁明顯;D-半乳糖組可見組織結構疏松,部分神經元細胞核固縮,胞體縮小變形,神經元細胞周圍間隙增寬;睪酮干預組可見細胞結構清楚,神經元細胞數目較D-半乳糖組增多,核深染,核膜清晰,核仁明顯。 3.各組小鼠下丘腦SA-β-半乳糖甘酶染色陽性細胞百分比 SA-β-半乳糖甘酶染色顯示衰老細胞胞漿和胞核藍染,定為陽性細胞。計算各組染色陽性細胞百分比后發(fā)現,D-半乳糖組染色陽性細胞百分比較正常對照組明顯升高(P0.05),符合衰老細胞特征。睪酮干預使染色陽性細胞百分比較衰老組明顯降低(P0.05),但仍高于正常對照組(P0.05)。 4.各組小鼠下丘腦p16~(INK4a)蛋白表達陽性細胞率 與正常對照組比較,D-半乳糖組小鼠下丘腦p16~(INK4a)蛋白表達陽性細胞率明顯升高,差異有顯著性(P0.05);與D-半乳糖組比較,睪酮干預組小鼠下丘腦p16~(INK4a)蛋白表達陽性細胞率明顯降低,差異有顯著性(P0.05),但仍高于正常對照組(P0.05)。 結論: 1.亞急性衰老小鼠下丘腦HE染色可見部分神經元細胞核固縮,衰老相關β-半乳糖甘酶染色陽性細胞百分比升高,p16~(INK4a)表達增多,說明D-半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠下丘腦發(fā)生了衰老。 2.睪酮干預可降低衰老相關β-半乳糖甘酶活性,延緩小鼠下丘腦的衰老。 3.睪酮對小鼠下丘腦衰老的干預作用部分是通過下調p16~(INK4a)蛋白表達來實現的。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R33

【參考文獻】

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1 孫茂民;劉s，

本文編號：2399080