【摘要】：腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子,參與各種不同的細(xì)胞活動(dòng),其中包括誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生,細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。TNF-α首先被合成26 kDa的膜結(jié)合因子(跨膜腫瘤壞死因子-α,transmembraneTNF-alpha,tmTNF-α),在金屬蛋白酶或其他酶類的作用下,從細(xì)胞膜外表面被剪切為17 kDa的可溶性分子(分泌型腫瘤壞死因子-α,secreted TNF-alpha,sTNF-α)。兩型TNF-α以不同親和力與TNFR1和TNFR2結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能。 細(xì)胞骨架蛋白Actin已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用,其中包括sTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。但是,Actin是否參與tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞胞毒作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)tmTNF-α在殺傷靶細(xì)胞HL-60的時(shí)候,可和Actin發(fā)生免疫共沉淀。故本研究的上篇以HL-60為靶細(xì)胞,探討tmTNF-α殺傷信號(hào)和靶細(xì)胞骨架蛋白Actin之間的關(guān)系。 此外,tmTNF-α如何啟動(dòng)TNFR2凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究下篇以HepG2細(xì)胞為模型,研究tmTNF-α誘導(dǎo)TNFR2凋亡信號(hào)復(fù)合物的形成,為干預(yù)臨床腫瘤探尋新的分子靶點(diǎn)。 上篇骨架蛋白Actin參與tmTNF-α殺傷信號(hào)的研究 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 一.CytD對(duì)Actin聚合的影響:在不同的時(shí)間點(diǎn)使用非中毒劑量的CytD(2μM)來(lái)處理HL-60細(xì)胞,激光共聚焦圖像顯示,在對(duì)照組細(xì)胞中,Actin主要分布于細(xì)胞核周?chē)约凹?xì)胞膜下。但是隨著CytD作用時(shí)間的延長(zhǎng),Actin明顯分散于細(xì)胞胞漿中,且細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組細(xì)胞。 二.CytD預(yù)先作用靶細(xì)胞時(shí)間對(duì)tmTNF-α殺傷作用的影響:采用MTT方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),tmTNF-的細(xì)胞胞毒作用隨著CytD預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在CytD預(yù)作用120min時(shí),其對(duì)Actin的聚合和tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞胞毒作用的抑制強(qiáng)度最大,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用2μM CytD預(yù)處理2小時(shí)。使用特異性抗體中和tmTNF-α的作用,完全抑制了這種膜分子的細(xì)胞毒效應(yīng)。 三.Actin解聚抑制了tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡:采用AnnexinV-PI方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組細(xì)胞相比,HL-60細(xì)胞對(duì)sTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞胞毒作用是抵抗的,但卻對(duì)tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡很敏感,凋亡率約50%。反之,用CytD使Actin解聚,可明顯抑制降低HL-60細(xì)胞對(duì)tmTNF-α的敏感性。這些數(shù)據(jù)充分表明Actin與tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用密切相關(guān)。 四.TNFR 1和TNFR2抗體交叉反應(yīng)的鑒定:采用Western方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),抗TNFR1的單克隆抗體只能檢測(cè)到人sTNFR1和HL-60細(xì)胞中的TNFR1,而抗TNFR2的單克隆抗體只能檢測(cè)到人sTNFR2和HL-60細(xì)胞中的TNFR2。提示這兩種抗TNFR1和抗TNFR2的單克隆抗體不存在交叉反應(yīng),可以用于后續(xù)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。 五.Actin解聚影響TNF-α介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo): 1.對(duì)TNFR1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,經(jīng)Actin解聚后,sTNF-α刺激使TNFR1上募集的SODD明顯減少;而其它各處理組TNFR1上募集的SODD無(wú)明顯改變。tmTNF-α和sTNF-α可明顯促進(jìn)TNFR1募集TRAF1和RIP1,用CytD解聚Actin后無(wú)明顯變化。 2.對(duì)TNFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNFR2不能募集SODD;tmTNF-α可明顯促進(jìn)TNFR2募集RIP1,卻抑制TRAF1的募集;而sTNF-α則反之,促進(jìn)TNFR2募集TRAF1,卻抑制RIP分子向TNFR2的聚集。用CytD解聚Actin,則逆轉(zhuǎn)tmTNF-α的信號(hào),促進(jìn)TNFR2募集TRAF1,卻抑制RIP1向TNFR2的聚集;Actin解聚同樣抑制sTNF-α誘導(dǎo)的TRAF1募集,但對(duì)RIP1則無(wú)影響。上述結(jié)果提示Actin參與兩型TNF-α不同的信號(hào)通路,且主要與TNFR2相關(guān)。 六.tmTNF-α介導(dǎo)的TNFR2與Actin的相互作用可以被CytD阻斷:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)證實(shí),Actin可少量與TNFR1發(fā)生免疫共沉淀,且各處理因素對(duì)之無(wú)影響。相反,tmTNF-α可明顯增加Actin與TNFR2共沉淀的量,然而,用CytD促進(jìn)Actin解聚則完全阻斷了tmTNF-α誘導(dǎo)的Actin與TNFR2的結(jié)合。提示Actin主要通過(guò)TNFR2而不是TNFR1來(lái)參與tmTNF-α介導(dǎo)的調(diào)亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 七.Actin解聚對(duì)TNF及其受體表達(dá)的影響:采用FCM檢測(cè)證實(shí),CytD的預(yù)處理導(dǎo)致該細(xì)胞TNFR2表達(dá)明顯降低,但對(duì)TNFR1的表達(dá)卻并無(wú)影響。由于Actin解聚對(duì)細(xì)胞裂解物中TNFR2的總量并無(wú)影響,提示Actin可能影響TNFR2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面,而并不影響它的合成。同時(shí),用CytD進(jìn)行預(yù)處理可導(dǎo)致細(xì)胞表面tmTNF-α表達(dá)明顯增加。 八.Actin解聚阻斷tmTNF-α誘導(dǎo)的TRAF2與TNFR2的解離:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),tmTNF-α的刺激使TRAF2與TNFR2結(jié)合減少,但CytD的預(yù)處理可完全阻斷tmTNF-α的這種作用,反而促進(jìn)TNFR2對(duì)TRAF2分子的募集。激光共聚焦圖像顯示,無(wú)論有無(wú)tmTNF-α,Actin都分布在細(xì)胞膜下以及細(xì)胞核周?chē)募?xì)胞胞漿中,且TRAF2在胞漿中呈彌散分布。相反,CytD導(dǎo)致Actin彌散性分布,并促進(jìn)tmTNF-α刺激的細(xì)胞中TRAF2從胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位。然而,單獨(dú)使用CytD卻不能導(dǎo)致TRAF2的轉(zhuǎn)位。提示Actin的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)tmTNF-α導(dǎo)致的TRAF2與TNFR2的解離。 九.Actin解聚抑制tmTNF-α誘導(dǎo)的TNFR2對(duì)RIP1的募集:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),tmTNF-α促進(jìn)TNFR2復(fù)合物對(duì)RIP1的募集。相反,CytD可完全阻斷tmTNF-α介導(dǎo)的RIP1向TNFR2的募集。激光共聚焦圖像顯示,tmTNF-α誘導(dǎo)RIP1從胞漿到胞膜的轉(zhuǎn)位以及RIP1與聚集的Actin共定位。然而,CytD解聚Actin,導(dǎo)致RIP1彌散分布在細(xì)胞胞漿中。這些結(jié)果顯示Actin的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)促進(jìn)了tmTNF-α誘導(dǎo)的TNFR2復(fù)合物對(duì)RIP1的募集。 十.Actin的解聚逆轉(zhuǎn)了tmTNF-α誘導(dǎo)的NF-κB失活:采用Western方法檢測(cè)顯示,tmTNF-α使細(xì)胞胞漿中IκB-α的水平升高,提示IκB-α組成性降解受到tmTNF-α的抑制。然而,CytD預(yù)處理則阻斷tmTNF-α的抑制作用。采用ELISA方法檢測(cè)顯示,tmTNF-α顯著地抑制HL-60細(xì)胞中NF-κB組成性活化,而CyotD則封閉了tmTNF-α的這一效應(yīng),并恢復(fù)了NF-κB的活性。此外,CytD單獨(dú)處理對(duì)于NF-κB的活性并無(wú)影響。 十一.Actin解聚阻斷tmTNF-α誘導(dǎo)的Caspase-8活化及其對(duì)RIP1的剪切: 1.在TNFR2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Caspase-8活性的變化:采用Western方法檢測(cè)顯示,在tmTNF-α刺激下,Caspase-8的激活最早在3h被觀察到,在12 h最為明顯。 2.Actin解聚對(duì)tmTNF-α誘導(dǎo)Caspase-8活化及其RIP1剪切的影響:采用Western方法檢測(cè)顯示,tmTNF-α激活的Caspase-8能剪切RIP1。與此相反的是,CytD預(yù)處理明顯抑制了tmTNF-α對(duì)Caspase-8的激活,并因此降低了后者對(duì)RIP1的剪切。 3.Z-IETD-FMK對(duì)tmTNF-α誘導(dǎo)Caspase-8活化及其RIP1剪切的影響:采用Western方法檢測(cè)顯示,Caspase-8抑制劑Z-IETD-FMK能完全阻斷tmTNF-α誘導(dǎo)的Caspase-8的活化及其對(duì)RIP1的剪切。 4.Z-IETD-FMK對(duì)tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響:采用Western方法和MTT方法檢測(cè)顯示,Z-IETD-FMK能完全封閉了tmTNF-α抑制IκB-α降解及其介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。 十二.Actin解聚阻斷tmTNF-α抑制cFLIP的表達(dá)及其募集: 1.Actin解聚對(duì)tmTNF-α抑制cFLIP向TNFR2募集的影響:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)顯示,tmTNF-α的刺激減少了TNFR2和cFLIP的結(jié)合。與此相反,CytD預(yù)處理完全封閉了tmTNF-α的這種作用,并使cFLIP與TNFR2結(jié)合增加。 2.Actin解聚對(duì)tmTNF-α抑制cFLIP表達(dá)的影響:采用Western方法檢測(cè)顯示,cFLIP的表達(dá)在tmTNF-α刺激12 h后幾乎完全被抑制,而CytD則完全阻斷了tmTNF-α的這種作用,并使cFLIP的表達(dá)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。 下篇tmTNF-α誘導(dǎo)TNFR2凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 一.九株腫瘤細(xì)胞表面tmTNF-α與TNFR的表達(dá):采用FCM方法檢測(cè)結(jié)果顯示,HeLa細(xì)胞株以表達(dá)TNFR1為主,K562、Raji和HepG2細(xì)胞株則以表達(dá)TNFR2為主,而1號(hào)MCF-7、T24和239細(xì)胞株的tmTNF-α和TNFR表達(dá)率均較低且無(wú)明顯差異,3號(hào)MCF-7細(xì)胞株的tmTNF-α和TNFR表達(dá)率均較高且無(wú)明顯差異。 二.Caspase抑制劑對(duì)tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響:采用MTT方法檢測(cè)結(jié)果顯示,caspase的泛抑制劑Z-VAD-FMK可使tmTNF-α對(duì)2號(hào)MCF-7、HeLa、HepG2和T24細(xì)胞株的胞毒作用受到明顯抑制;但是,該抑制劑對(duì)tmTNF-α殺傷3號(hào)MCF-7細(xì)胞株則無(wú)明顯影響。提示tmTNF-α的殺傷作用盡管需要依賴caspase,但是也可通過(guò)caspase非依賴性途徑殺傷靶細(xì)胞。 三.tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Caspase-8和Caspase-3的活化 1.tmTNF-α介導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞凋亡中caspase的表達(dá):采用western方法檢測(cè)結(jié)果顯示,用tmTNF-α刺激MCF-7細(xì)胞,Caspase-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的含量無(wú)明顯變化。 2.tmTNF-α介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡中caspase的活化:采用western方法檢測(cè)結(jié)果顯示,用tmTNF-α刺激以表達(dá)TNFR1為主的HeLa細(xì)胞,Caspase-8最早在6 h被剪切活化,且隨刺激時(shí)間延長(zhǎng),其活化逐漸增加。同時(shí),Caspase-3含量也逐漸減少。其它各caspase含量基本無(wú)明顯變化。 3.tmTNF-α介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡中caspase的活化:采用western方法檢測(cè)結(jié)果顯示,用tmTNF-α刺激以表達(dá)TNFR2為主的HepG2細(xì)胞,Caspase-8最早在24 h時(shí)被剪切。同時(shí),Caspase-3含量也逐漸減少。其它各caspase含量基本無(wú)明顯變化。 4.tmTNF-α介導(dǎo)的T24細(xì)胞凋亡中caspase的活化:采用western方法檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著tmTNF-α刺激時(shí)間的延長(zhǎng),T24細(xì)胞株中的Caspase-8最早在6 h時(shí)被剪切,其活化逐漸增加。同時(shí),Caspase-3含量也逐漸減少。其它各caspase含量基本無(wú)明顯變化。 上述結(jié)果提示tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Caspase-8和Caspase-3相關(guān)。TNFR表達(dá)類型的差異,可能影響Caspase-8活化的時(shí)間。以下我們選用表達(dá)TNFR2為主的HepG2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 四.兩型TNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞的胞毒作用:采用MTT方法檢測(cè)結(jié)果證實(shí),tmTNF-α可有效殺傷靶細(xì)胞,其誘導(dǎo)的凋亡率約40%;但是,sTNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)殺傷作用。用放線菌素D可部分增加HepG2細(xì)胞對(duì)sTNF-α介導(dǎo)的胞毒作用的敏感性。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-α對(duì)同一靶細(xì)胞可誘導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。 五.tmTNF-α作用12 h對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響:采用PI染色方法檢測(cè)結(jié)果證實(shí),刺激12 h后tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率約為50%,而HepG2細(xì)胞則明顯抵抗sTNF-α的殺傷效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在明顯差異。 六.兩型TNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響:采用PI染色方法檢測(cè)結(jié)果顯示,刺激12 h后tmTNF-α組出現(xiàn)明顯的亞G1峰,同時(shí)G1期的細(xì)胞約減少了40%,提示tmTNF-α主要誘導(dǎo)G1期細(xì)胞凋亡。而sTNF-α則導(dǎo)致S期細(xì)胞量增加。 七.tmTNF-α通過(guò)TNFR2募集促凋亡信號(hào)分子:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)結(jié)果顯示,刺激15 min時(shí)tmTNF-α刺激TNFR2募集FADD、RIP1和Caspase-8;刺激25 min時(shí)tmTNF-α刺激TNFR2僅募集FADD和RIP1。相反,sTNF-α則完全抑制TNFR2對(duì)上述分子的募集。同時(shí),我們未檢測(cè)出TNFR2對(duì)TRADD的募集。 八.tmTNF-α抑制TNFR2募集抗凋亡信號(hào)分子:采用免疫共沉淀方法檢測(cè)結(jié)果顯示,tmTNF-α抑制了TNFR2對(duì)TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2、和cFLIP的募集。相反,sTNF-α則增強(qiáng)了TNFR2對(duì)這六個(gè)信號(hào)分子的募集。同時(shí),sTNF-α可能通過(guò)TRAF2將NIK招募到TNFR2復(fù)合物中,而tmTNF-α則無(wú)此作用。 九.tmTNF-α介導(dǎo)NF-κB的失活與sTNF-α介導(dǎo)NF-κB的活化:采用ELISA方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),tmTNF-α引起HepG2細(xì)胞組成性活化的NF-κB受到顯著性抑制,而sTNF-α則可使NF-κB進(jìn)一步活化。 綜上所述,兩型TNF-α啟動(dòng)HepG2細(xì)胞的TNR2信號(hào)通路不同,tmTNF-α主要誘導(dǎo)TNFR2凋亡信號(hào)復(fù)合物(FADD/RIP1/Caspase-8)形成,而sTNF-α則主要誘導(dǎo)TNFR2抗凋亡信號(hào)復(fù)合物(TRAF1-3/clAP1-2/cFLIP)形成,進(jìn)而分別導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡或存活。此外,Actin主要參與tmTNF-α啟動(dòng)TNFR2的凋亡信號(hào)通路,即促進(jìn)TNFR2募集RIP1,導(dǎo)致TRAF2和cFLIP與TNFR2的解離,從而促進(jìn)Caspase-8活化及其對(duì)RIP1的剪切,進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB失活,并通過(guò)caspase級(jí)聯(lián)系統(tǒng)介導(dǎo)tmTNF-α的致凋亡效應(yīng)。 該研究不但為深入闡明兩型TNF-α的生物學(xué)特征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且為臨床抗腫瘤治療提供新的分子靶點(diǎn)和干預(yù)線索。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 葉飛,李卓婭,尹丙姣,龔非力,姜曉丹,馮瑋,徐勇,熊平;人可溶性TNF受體(sTNFRI)在大腸桿菌中的表達(dá)及其活性鑒定[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2002年11期

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本文編號(hào)：2398985