【摘要】： 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,在生理或病理因素刺激下,可從骨髓被動(dòng)員到外周血進(jìn)行損傷的修復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞又稱為血管母細(xì)胞(angioblast),既參與出生后的血管生成(angiogenesis,AG),同時(shí)亦參與機(jī)體、器官損傷后的血管再生與修復(fù)。血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)是血液和周圍組織的一道屏障,光滑連續(xù)的EC層保證了血液中各種細(xì)胞在血管里正常的流動(dòng),并分泌某些重要的調(diào)節(jié)因子,如一氧化氮(NitricOxide,NO)等。在正常情況下,體循環(huán)中有極少量來源于血管壁的EC,維持其正常水平的更新。而當(dāng)EC大量損傷時(shí),則無法滿足內(nèi)皮層愈合的需要。近年來多項(xiàng)研究證實(shí),來源于骨髓的EPC能在缺血或血管損傷時(shí)動(dòng)員至體循環(huán)中,并募集在缺血或損傷處分化為成熟的EC,形成新生血管。大量的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證明:當(dāng)組織受到損傷時(shí),尤其是缺血性損傷時(shí),循環(huán)及組織中EPC動(dòng)員和增殖能力增強(qiáng),并可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞替換功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞、修補(bǔ)裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū),并參與缺血或損傷組織內(nèi)新血管生成,從而改善的功能。 近年來的研究顯示,內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用。且臨床上通過EPC移植治療缺血性疾病獲得成功,具有廣闊的應(yīng)用前景。但是無論從骨髓、臍血、胚胎肝和外周血中分離培養(yǎng)出EPC數(shù)量都非常有限,不能滿足實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用的需要,這是目前限制內(nèi)皮祖細(xì)胞的廣泛應(yīng)用的一個(gè)主要原因。因此,探討如何培養(yǎng)擴(kuò)增出大量穩(wěn)定的內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法很有必要。本研究將根據(jù)內(nèi)皮譜系細(xì)胞的特性,參照國內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)及鑒定方案,在實(shí)驗(yàn)中反復(fù)摸索,得出影響EPC培養(yǎng)擴(kuò)增的主要因素,通過生長曲線及增值倍數(shù)對(duì)常用分離培養(yǎng)條件及方法進(jìn)行比較,并予鑒定及功能檢測,得出最佳方案。為移植內(nèi)皮祖細(xì)胞在治療心血管疾病及多器官功能障礙綜合癥奠定良好的基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)研究共分兩部分: 第一部分:目的:通過對(duì)國內(nèi)外常用方法的比較建立起小型豬骨髓EPC的標(biāo)準(zhǔn)化分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法,為內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植奠定基礎(chǔ)。方法:(1)利用無菌技術(shù)在豬髂骨抽取骨髓,用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞,并予誘導(dǎo)分化。對(duì)不同的培養(yǎng)條件及方法進(jìn)行分組:A組(按P0接種密度)、B組(按P0換液時(shí)間)、C組(按P4代接種密度)、D組(按基礎(chǔ)培養(yǎng)液)、E組(按血清濃度)、F組(按包被液)、(按細(xì)胞因子濃度)G組(VEGF)、H組(bFGF)、I組(EGF)、J組(IGF),培養(yǎng)擴(kuò)增出大量穩(wěn)定的內(nèi)皮祖細(xì)胞;(2)對(duì)原代EPC行細(xì)胞集落個(gè)數(shù)及EPC獲得率比較,成熟后EPC通過比較細(xì)胞的生長曲線及15天增殖倍數(shù);(3)利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)、分析、比較。結(jié)果:通過各種不同培養(yǎng)條件及方法得到的EPC細(xì)胞形態(tài)基本相似,但實(shí)施每組各水平細(xì)胞的生長速度及增殖情況不一。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析A、B組,不同水平間均有差異(P＜0.05),以實(shí)施A②、B③方法的原代集落個(gè)數(shù)生成最多,EPC獲得率相對(duì)較高。C、D、E、F、G、I、J組中,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析C、D組,不同水平間均有差異(P＜0.05),而E組③、④,F組②、③、④,G組④、⑤,H組③、④,I組③、④,J組③、④無明顯差異(P＞0.05),但與其他水平之間均有差異(P＜0.05);以實(shí)施C組②,D組②,E組③、④,F組②、③、④,G組④、⑤,H組③、④,I組③、④,J組③、④的培養(yǎng)的細(xì)胞生成曲線每天值均較高,生長趨勢較好,在15天內(nèi)細(xì)胞增殖倍數(shù)最多。結(jié)論:經(jīng)比較得出最佳培養(yǎng)方案:原代接種密度為1×10~6/cm~2,原代換液時(shí)間及方法為接種24h棄貼壁取懸浮細(xì)胞接種,48h、72h、96h均換液后取貼壁細(xì)胞繼續(xù)接種培養(yǎng),P4代及以后接種密度為1×10~4/cm~2,包被液(1%明膠、2%FN、1%明膠和2%FN 1:1),最佳培養(yǎng)液為M199+10%FBS+VEGF10ng/ml+bFGF50ng/ml+IGF50ng/ml+EG20ng/ml。 第二部分目的:鑒定培養(yǎng)擴(kuò)增出的內(nèi)皮祖細(xì)胞并測定其功能,保證分離及培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞的性質(zhì)及純度。方法:(1)以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙色熒光染色法和用CD133、CD34、CD31、KDR等表型表達(dá)行免疫組化鑒定EPC及流式細(xì)胞儀(FACS)檢測EPC純度;(2)體外血管生成功能試驗(yàn)、遷徙實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量測定分析EPC功能。結(jié)果:(1)均行Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1雙染及免疫組化、流式細(xì)胞儀檢測CD133、CD34、CD31、KDR等的陽性率符合EPC表型特征;(2)體外血管生成功能試驗(yàn)、遷徙實(shí)驗(yàn)陽性,本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量明顯高于傳統(tǒng)普通培養(yǎng)的細(xì)胞(P＜0.05)。結(jié)論:本研究采用綜合的鑒定體系(形態(tài)特征、免疫組化、流式細(xì)胞儀、雙色熒光、體外血管生成功能試驗(yàn)、遷徙實(shí)驗(yàn)、一氧化氮(NO)含量測定等)所得結(jié)果與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致,完全可證明我們培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞即是EPC。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙旭東;林建華;;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在妊娠期高血壓疾病研究的最新進(jìn)展[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2009年06期

2 姜萌;王長謙;王彬堯;何奔;邵琴;黃定九;;低氧誘導(dǎo)因子過表達(dá)對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分化影響的體外研究[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2006年03期

3 王秀華;賈兵;陳張根;王克強(qiáng);;誘導(dǎo)臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞的研究[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2006年20期

4 池一凡;孫龍;侯文明;孫忠東;牛兆倬;孫勇;;大鼠外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)的表型變化特征[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年04期

5 邵春益;傅瑤;陸雯娟;范先群;;人骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[J];眼科;2009年06期

6 崔斌;黃嵐;耿召華;方玉強(qiáng);宋明寶;趙曉輝;;人循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化[J];重慶醫(yī)學(xué);2006年05期

7 王三明;陳小東;李建文;黃水傳;張遠(yuǎn)起;張智;;大鼠骨髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究[J];廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年04期

8 何朝榮,張群林,黃從新;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成內(nèi)皮細(xì)胞能力的研究[J];中華老年多器官疾病雜志;2003年04期

9 邵琴;王長謙;范華驊;姜萌;劉[?;聶曉絢;高躒;;臍血、外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];心臟雜志;2006年01期

10 胡月明;金曉明;李紅霞;;大鼠骨髓EPC的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性鑒定[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 賈紅亮;呂海濤;孫凌;張建敏;嚴(yán)文華;朱伯會(huì);曹磊;周萬平;丁粵粵;;辛伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞釋放微顆粒的影響及其機(jī)制的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊）[C];2010年

2 馬向紅;黃體鋼;楊萬松;周麗娟;;四氫生物喋呤對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和超氧陰離子的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)第八次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2004年

3 冷曄;丁祖泉;高艷琴;;剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞—小腸黏膜下基質(zhì)復(fù)合培養(yǎng)物的影響[A];第八屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

4 宋明寶;于學(xué)軍;朱光旭;;鈣離子跨縫隙連接在內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間傳遞的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

5 武曉靜;黃嵐;趙剛;;內(nèi)皮細(xì)胞表型改變對(duì)平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換及遷移的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 蔡紹皙;陳斯佳;于文娟;;針刺,作為物理刺激對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員作用[A];第十一次中國生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

7 林云鋒;田衛(wèi)東;陳希哲;閆征斌;喬鞠;李志勇;劉磊;鄭曉輝;湯煒;;大鼠脂肪源性內(nèi)皮細(xì)胞成脂潛能的研究[A];2005'中國修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

8 馬剛;林曉曦;金云波;李偉;王維;胡曉潔;許志成;楊川;;嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[A];第四屆華東六省一市整形外科學(xué)術(shù)會(huì)議暨2007年浙江省整形、美容學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

9 易龍;陳春燁;金鑫;于斌;舒芙蓉;麋漫天;;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)[A];中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)第十次全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第七屆會(huì)員代表大會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

10 單志新;林秋雄;楊敏;鄧春玉;朱杰寧;麥麗萍;符永恒;林曙光;余細(xì)勇;;血管緊張素Ⅱ通過AP-1調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的表達(dá)[A];第十三次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 吳一福;西京醫(yī)院振蕩法支架種植內(nèi)皮細(xì)胞獲成功[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

2 ;中藥抗血栓機(jī)理及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生物醫(yī)學(xué)研究取得佳績[N];科技日報(bào);2000年

3 趙軍;耳毒性藥物對(duì)耳蝸螺旋動(dòng)脈平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞電生理特性的影響項(xiàng)目[N];科技日報(bào);2007年

4 吳一福;PTFE血管材料可攜載VEGF基因轉(zhuǎn)染[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

5 楊茜;美學(xué)者發(fā)現(xiàn)抗癌藥新生物指標(biāo)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

6 衣曉峰 李媛媛;化療可以有另一種方式[N];健康報(bào);2006年

7 紀(jì)英超;Tumsatatin使腫瘤細(xì)胞糧盡援絕[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

8 楊春;傷口暴露好還是濕敷好[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2001年

9 衣曉峰 李媛媛;晚期肺癌化療有了低劑量給藥方式[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

10 衣曉峰 靳萬慶 本報(bào)記者　 □ 李媛媛 本報(bào)通訊員　;晚期肺癌低劑量化療給藥方式優(yōu)點(diǎn)多[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王s，

本文編號(hào)：2398934