【摘要】： 背景： 胃癌(Gastric Cancer)是全球常見腫瘤,全世界每年約有93.4萬胃癌新發(fā)病例,有70萬人死于胃癌,發(fā)病率居常見腫瘤第四位。在我國,胃癌死亡率占所有惡性腫瘤死亡率的23.02%,居各類癌癥死亡率首位。現(xiàn)階段,胃癌的診斷方法以X線和內(nèi)鏡超聲等為主,這對胃癌的早期診斷尚缺乏足夠的準(zhǔn)確性和特異性,在治療方面,以放療、化療和手術(shù)治療為主的綜合治療也因其副作用太大使其在臨床中的應(yīng)用受到了很多限制。所以,許多研究者把研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)向了胃癌的抗體診斷和治療,這對胃癌的防治將具有重要的意義。 抗體技術(shù)的應(yīng)用對醫(yī)學(xué)發(fā)展起了非常重要的推動(dòng)作用,被廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究、疾病的診斷和治療,其在疾病診斷、治療和預(yù)防等方面顯示出了重要作用。噬菌體抗體庫(Phage Antibody Library)的構(gòu)建以聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)和噬菌體展示(Phage Display Techniques, PDT)技術(shù)為基礎(chǔ),通過構(gòu)建人源性單鏈?zhǔn)删w抗體庫為獲得特異性抗體分子提供有效途徑。這不僅是一種制備人源性抗體的有效方法,而且能夠制備出具有大容量和多樣性較好的抗體庫,在獲得高親和力的抗體以及在對抗體性能進(jìn)行改造方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢。噬菌體抗體技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展使研究者能夠在體外模擬體內(nèi)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的整個(gè)過程,為人源抗體的制備提供了簡便而高效的可操作系統(tǒng),因而在多種疾病的預(yù)防、診斷和治療方面均具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。 目的： 利用基因工程方法和噬菌體抗體庫這一新興的生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建胃癌人源性ScFv噬菌體單鏈抗體庫,并初步鑒定其生物學(xué)特性,為胃癌的免疫診斷和免疫治療提供新載體。 方法： 1.取原發(fā)性胃癌患者癌周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)作為B細(xì)胞的來源,提取淋巴細(xì)胞的總RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(VH)和抗體輕鏈可變區(qū)(VL)基因片段,對VH、VL基因片段分別進(jìn)行酶切和凝膠回收純化；合成Linker連接肽,連接VL+Linker,再連VH形成VH-Linker-VL,然后,在抗體基因片段的兩端引入酶切位點(diǎn)Sfi I和Not I,最后利用“重疊延伸拼接PCR(Splicing by Overlap Extension Polymerase Chain Reaction, SOE-PCR)"技術(shù)將其拼接成完整的單鏈抗體(ScFv)基因片段。 2.噬菌體單鏈抗體(ScFv)與載體pCANTAB-5E拼接,構(gòu)建抗體庫：單鏈抗體ScFv基因片段用限制性內(nèi)切酶Sfi I, Not I分步酶切后,凝膠回收純化酶切產(chǎn)物并通過連接反應(yīng)將單鏈抗體ScFv與載體pCANTAB-5E連接,制備轉(zhuǎn)化效率達(dá)到6.0×107cfu/ug pUC的高濃度感受態(tài)大腸桿菌TGl,將插入單鏈抗體ScFv的噬菌體載體pCANTAB-5E轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1,經(jīng)輔助噬菌體M13K07超感染,噬菌體展示即可制備出單鏈?zhǔn)删wScFv抗體庫,對抗體庫的庫容量與重組率進(jìn)行檢測。 結(jié)果： 1.結(jié)果顯示：從胃癌癌周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中提取的總RNA在瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中可見明顯的28S和18S兩條帶,提示RNA的完整性良好；重鏈VH基因片段的大小為375bp,輕鏈VL基因片段的大小為325bp；組裝后的ScFv基因片段(VH-Linker-VL) PCR擴(kuò)增顯示長度為750bp。 2.獲得4.7×107cfu/ug氨芐青霉素抗性克隆。以適量轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌液鋪平板,隨機(jī)提取10個(gè)克隆,小提載體質(zhì)粒DNA后以Sfi I和Not I分步酶切鑒定,陽性插入率為80%(8/10)。經(jīng)測序證實(shí)抗體重鏈和輕鏈以整碼的單鏈抗體方式準(zhǔn)確插入了載體,同源性為91%。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了庫容量為4.7×107cfu/ug的ScFv噬菌體抗體庫,重組率為80%(8/10),重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因序列同源性為91%。結(jié)果表明通過噬菌體抗體庫技術(shù)(Phage Antibody Library Technology)可以直接從腫瘤病人的癌周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中獲得腫瘤相關(guān)的完全人源的基因片段,為今后制備各種抗體提供了技術(shù)平臺(tái)和思路,希望為后續(xù)的特異性抗體篩選研究提供技術(shù)和物質(zhì)支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392;R735.2

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本文編號(hào)：2397068