【摘要】： 結核病是一種人獸共患的慢性消耗性傳染病,已成為傳染病中的第一號殺手和最大的死亡原因。特別在發(fā)展中國家結核病對于感染免疫缺陷病毒的人群來說尤為嚴重。隨著艾滋病患者人數(shù)的增加、耐藥性菌株的產(chǎn)生,結核病的發(fā)病率有逐年增加的趨勢。因此,對于病情的流行,早期的感染診斷很關鍵,急需進一步改進現(xiàn)有的診斷方法。lhp基因是結核分枝桿菌特異性基因,在疫苗株BCG及環(huán)境中的非結核分枝桿菌中缺失。lhp與細菌的毒力相關,其缺失可以降低結核分枝桿菌的毒力。CFP-10是lhp的表達蛋白。本研究構建了原核表達CFP-10蛋白的重組大腸桿菌,獲得具有生物活性的融合蛋白,并且制備了CFP-10特異性單克隆抗體。這些結果為研究結核分枝桿菌致病機理及免疫機理提供了重要條件,同時,為結核病診斷與檢疫提供了新的試劑。 一、結核分枝桿菌lhp基因的原核表達 CFP-10作為免疫優(yōu)勢抗原,其功能研究可以加深對結核分枝桿致病機制、免疫機制的研究。本研究采用PCR及GeneSOEing技術分別擴增出lhp基因及l(fā)hp-linker-esat-6片段,分別插入原核表達載體,構建出重組菌BL21-pGEX-6p-1-lhp和BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp-linker-esat-6,經(jīng)IPTG誘導表達得到融合蛋白。SDS-PAGE結果顯示表達的融合蛋白GST-CFP-10和His-CFP-10-linker-ESAT-6與理論值大小相符,為進一步研究該蛋白的免疫學功能提供了條件。 二、結核分枝桿菌CFP-10蛋白單克隆抗體的制備與鑒定 應用淋巴細胞雜交瘤技術,以重組菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp表達的融合蛋白His-CFP-10為免疫原經(jīng)純化免疫8周齡BALB/c小鼠,皮下注射,100μg/只。首免時,抗原與等量弗氏完全佐劑混合乳化;二免、三免時抗原與等量不完全弗氏佐劑混合乳化,間隔時間為兩周;以不加佐劑的抗原尾靜脈加強免疫,100μg/只,3d后,取免疫鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0-Ag-14進行融合。以純化的GST-CFP-10作為檢測抗原,用間接ELISA方法篩選陽性克隆,獲得7株穩(wěn)定分泌CFP-10 McAb的細胞株,命名為2E7、6E8、7B11、7C2、7C3、7D4、8F6,腹水的效價依次為1×10~6、1×10~6、1×10~6、1×10~5、1×10~5、1×10~4、1×10~4。除6E8、7811 McAb亞類為IgG1外,其余均為IgG2b。Dot-ELISA試驗表明,7株單抗只與表達His-CFP-10、GST-CFP-10及His-CFP-10-linker-ESAT-6的重組大腸桿菌反應,與其它菌株不反應。Western-blot試驗顯示7株單抗均能與融合蛋白His-CFP-10發(fā)生反應,出現(xiàn)特異性條帶,而與BL21(DE3)-pET-30a(+)不反應。以上試驗證實,篩選獲得的McAb 2E7、6E8、7811、7C2、7C3、7D4、8F6是針對CFP-10的特異性單克隆抗體,它們?yōu)檠芯拷Y核分枝桿菌CFP-10蛋白功能以及結核病的診斷提供了重要的條件。
[Abstract]:Tuberculosis (TB) is a chronic and consumptive infectious disease, which has become the number one killer and the biggest cause of death among infectious diseases. Tuberculosis, especially in developing countries, is especially severe among people infected with HIV. With the increase of the number of AIDS patients and the production of drug-resistant strains, the incidence of tuberculosis is increasing year by year. Therefore, for the prevalence of the disease, the early diagnosis of infection is very important. It is urgent to further improve the existing diagnostic methods. Lhp gene is a specific gene of Mycobacterium tuberculosis. Lhp is associated with the virulence of the bacteria, which can reduce the virulence of Mycobacterium tuberculosis. CFP-10 is the expressed protein of lhp. In this study, recombinant Escherichia coli expressing CFP-10 protein was constructed, and bioactive fusion protein was obtained, and CFP-10 specific monoclonal antibody was prepared. These results provide important conditions for studying the pathogenic mechanism and immune mechanism of Mycobacterium tuberculosis, and provide a new reagent for the diagnosis and quarantine of tuberculosis. Firstly, the prokaryotic expression of CFP-10 in the lhp gene of Mycobacterium tuberculosis is the dominant antigen, and its function can deepen the study on the pathogenic mechanism and immune mechanism of Mycobacterium tuberculosis. In this study, lhp gene and lhp-linker-esat-6 fragment were amplified by PCR and GeneSOEing, respectively, and inserted into prokaryotic expression vector respectively. The recombinant bacteria BL21-pGEX-6p-1-lhp and BL21 (DE3) -pET-30a () -lhp-linker-esat-6, were constructed. The expression of the fusion protein was induced by IPTG. The results of SDS-PAGE showed that the expressed fusion proteins GST-CFP-10 and His-CFP-10-linker-ESAT-6 were in agreement with the theoretical values, which provided the conditions for further study of the immunological function of the fusion protein. Preparation and Identification of Monoclonal Antibody against Mycobacterium Tuberculosis CFP-10 protein using Lymphocyte hybridoma technique, The fusion protein His-CFP-10 expressed by recombinant strain BL21 (DE3)-pET-30a ()-lhp was used as immunogen to immunize 8-week-old BALB/c mice subcutaneously, 100 渭 g / mouse. The antigens were emulsified with the same amount of Freund's complete adjuvant for the first time, and the antigens and the same amount of incomplete Freund's adjuvant were mixed emulsified for the second and third immunity respectively, with the interval of two weeks. The immunized mice were immunized with non-adjuvant antigenic tail vein, 100 渭 g / mouse, 3 days later, the spleen cells of immunized mice were fused with Sp2/0-Ag-14 of mouse myeloma cells. The purified GST-CFP-10 was used as the detection antigen, and the positive clones were screened by indirect ELISA method. Seven cell lines secreting CFP-10 McAb stably were obtained, named as 2E7E7, 6E8, 7B11, 7C2C3, 7D4, 8F6, and the titer of ascites was 1 脳 1061 脳 1061 脳 1061 脳 1061 脳 1051 脳 10 1 脳 10 5 1 脳 10 1 脳 10 4. The titer of ascitic fluid was 1 脳 10 1 脳 10 6 1 脳 10 6. The titer of ascitic fluid was 1 脳 10 6 1 脳 10 6, 1 脳 10 5, 1 脳 10 5, 1 脳 10 4. With the exception of 6E8O7811 McAb subclass being IgG1, the IgG2b.Dot-ELISA test showed that the seven McAbs reacted only with recombinant Escherichia coli expressing His-CFP-10,GST-CFP-10 and His-CFP-10-linker-ESAT-6. Western-blot test showed that all of the seven McAbs could react with the fusion protein His-CFP-10 with specific bands, but not with BL21 (DE3)-pET-30a (). The results showed that McAb _ 2E7N _ 6E _ 8C _ (78) 7C _ (2) C _ (2) C _ (7) C _ (2) C _ (3) C _ (7) D _ (4) F _ (6) was a specific monoclonal antibody against CFP-10, which provided important conditions for studying the function of CFP-10 protein of Mycobacterium tuberculosis and the diagnosis of tuberculosis.
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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