【摘要】： 鼠疫是由鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)引起重要烈性傳染病,主要分為腺鼠疫、敗血癥鼠疫和肺鼠疫,其中肺鼠疫具有傳染性強(qiáng)和致死率高的特點(diǎn)。特別是近年鼠疫呈死灰復(fù)燃之勢,同時(shí)它又是重要的生物恐怖制劑之一,因此鼠疫已成為潛在威脅人類健康和國家安全的重大現(xiàn)實(shí)問題。 疫苗是有效防控傳染病的手段之一。由于傳統(tǒng)的鼠疫疫苗存在對(duì)肺鼠疫無效,并且副反應(yīng)大,至今沒有實(shí)用的人用疫苗�；诜问笠咄ㄟ^呼吸道感染的特點(diǎn),激發(fā)黏膜免疫反應(yīng)是預(yù)防肺鼠疫的研究重點(diǎn)。而傳統(tǒng)的鋁佐劑,注射后不能誘導(dǎo)粘膜免疫來阻斷和中和毒素;霍亂毒素等黏膜佐劑,黏膜免疫效果好,但副作用大等問題。因此,尋找安全、有效的黏膜佐劑用于鼠疫黏膜疫苗的研究非常重要。 蛋白體(Proteosome)是腦膜炎奈瑟氏雙球菌的外膜蛋白,是多個(gè)孔道蛋白形成的囊泡樣大小不同的豪微粒結(jié)構(gòu)體,具有疫苗投遞載體和佐劑的特征。PorB蛋白是腦膜炎雙球菌的重要外膜孔道蛋白之一,是蛋白體的主要組成成分,約占其組成的60%。PorB蛋白也有類似蛋白體的免疫增強(qiáng)劑活性。近幾年,國內(nèi)外把蛋白質(zhì)佐劑和從蛋白體中提取的PorB蛋白作為黏膜佐劑應(yīng)用在很多疫苗的研制中,主要用于鼻內(nèi)接種疫苗,并且具有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展,但是對(duì)PorB重組蛋白作為佐劑的研究還未見報(bào)道。 諸多研究發(fā)現(xiàn),鼠疫F1、V已成為鼠疫新一代疫苗研制的首選保護(hù)性抗原分子,也是鼠疫新型疫苗研究的重點(diǎn)。本研究以制備的蛋白體、PorB重組蛋白粘膜佐劑與鼠疫F1-V融合重組蛋白抗原按一定比例配置黏膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠,從粘膜免疫角度探討鼠疫F1-V融合重組蛋白黏膜疫苗誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)應(yīng)答效果,為篩選安全、有效鼠疫粘膜疫苗佐劑奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 首先,通過優(yōu)化的條件,從腦膜炎B群2b型奈瑟氏雙球菌中成功提取了高純度的蛋白體,其主要由PorA,PorB和4類孔道膜蛋白三種成分組成,相對(duì)分子質(zhì)量分別為41 ku,38 ku和34 ku。并且蛋白體中脂多糖、莢膜多糖和核酸的含量都符合生物制品佐劑的要求,且通過了異常毒性試驗(yàn)。證明了蛋白體作為疫苗佐劑的安全性,為疫苗的研究提供了黏膜佐劑。 然后,通過基因工程技術(shù),根據(jù)基因文庫中提供的目的基因序列設(shè)計(jì)引物,從B群2b型腦膜炎奈瑟氏雙球菌中擴(kuò)增porB的基因序列,將其克隆入表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建porB-pET28a(+)表達(dá)載體,通過IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)PorB重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的高表達(dá),并對(duì)純化的表達(dá)蛋白產(chǎn)物了進(jìn)行純化和Western blot鑒定,獲得了高純度的PorB重組蛋白,為進(jìn)一步深入研究黏膜佐劑效應(yīng)奠定了結(jié)實(shí)基礎(chǔ)。 最后,將PorB重組蛋白佐劑和蛋白體佐劑分別與鼠疫F1-V融合重組蛋白制備滴鼻疫苗劑型,并與鼠疫F1-V融合重組蛋白抗原做對(duì)照。分別滴鼻免疫Balb/c小鼠三次,取尾靜脈血,采用ELISA檢測血清IgG及抗體亞型分類,并檢測鼻咽、肺、小腸及陰道灌洗液sIgA;采用FAC檢測脾淋巴細(xì)胞表型的變化。在本試驗(yàn)中,PorB重組蛋白佐劑和蛋白體佐劑均可誘導(dǎo)小鼠在肺、鼻咽喉和陰道中產(chǎn)生較高的黏膜分泌型IgA抗體而且小鼠血清IgG抗體水平顯著高于鼠疫F1-V抗原組對(duì)照組,引起IgG1抗體為主,主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng);同時(shí)PorB重組蛋白佐劑和蛋白體佐劑還可顯著提高在脾臟中的CD4+細(xì)胞數(shù),免疫反應(yīng)趨向Th2反應(yīng)。而且在各項(xiàng)檢測中PorB重組蛋白佐劑疫苗組與蛋白體佐劑疫苗組無顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果表明,PorB重組蛋白佐劑和蛋白體佐劑均可顯著提高鼠疫F1-V融合重組蛋白疫苗的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答,且PorB重組蛋白佐劑的免疫效果可與蛋白體佐劑相媲美。 結(jié)論,PorB重組蛋白佐劑可用于鼠疫F1-V融合重組蛋白黏膜疫苗的研究,為鼠疫安全、有效免疫預(yù)防奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)也為其它黏膜感染性疾病疫苗的研究提供了保證。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2395888