【摘要】：目的:骨髓中存在一定數(shù)量的骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem ce11s,MSCs),這些細胞具有自我復(fù)制能力,在特定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為骨、軟骨和脂肪等。將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為成骨、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞等,為修復(fù)重建由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種組織缺損,提供了理想的治療手段,是一項非常具有應(yīng)用前景的技術(shù)。但是目前實驗室的培養(yǎng)規(guī)模,很難滿足臨床上對種子細胞數(shù)量的需求,迫切需要在生物反應(yīng)器上進行規(guī)�；纳a(chǎn),而在生物反應(yīng)器上的規(guī)�；a(chǎn),對細胞的數(shù)量即時監(jiān)測存在著很大的挑戰(zhàn)。 本實驗通過自制一套小規(guī)模灌注培養(yǎng)擴增的反應(yīng)器系統(tǒng),在該生物反應(yīng)器上進行連續(xù)灌注培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,通過監(jiān)測進出培養(yǎng)T瓶的培養(yǎng)液中的葡萄糖及乳酸即時濃度,CCK-8法測定該生物反應(yīng)器T瓶中的即時細胞數(shù)量,尋找他們之間的一種數(shù)學(xué)關(guān)系,通過監(jiān)測葡萄糖或乳酸濃度間接監(jiān)測到生物反應(yīng)器中細胞數(shù)量。并對在該生物反應(yīng)器上連續(xù)灌注培養(yǎng)后的細胞分化能力進行測定,比較與靜態(tài)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞的分化能力有無明顯的差異。 實驗方法:1.采用貼壁篩選法分離、培養(yǎng)、擴增大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況。 2. CCK-8法測定細胞數(shù)量,并作出細胞生長曲線。 3.向生長狀態(tài)良好的P3代靜態(tài)培養(yǎng)細胞及灌注培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細胞中加入成骨細胞誘導(dǎo)液(α-MEM培養(yǎng)液,15%胎牛血清,10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉,10-8M地塞米松,50μg/ml抗壞血酸)培養(yǎng)兩周。兩周后進行堿性磷酸酶活性測定,堿性磷酸酶染色和茜素紅染色。 4.當P3靜態(tài)培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細胞達到完全融合時,加入脂肪細胞誘導(dǎo)液(1μg/ml胰島素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L的IBMX及15%FBS的α-MEM),逐日觀察細胞變化,兩周后油紅O染色鑒定。 5.在24孔板上接種2×104cells/ml的間充質(zhì)干細胞3ml,靜態(tài)培養(yǎng),每3天換一次液,收集到的廢液在Nova Bioprofile 100+上檢測其葡萄糖、乳酸濃度,并對換液中的一組細胞進行消化,CCK-8計數(shù)。通過計算出葡萄糖消耗率、乳酸累計率及細胞數(shù)量,做出擬合曲線。 6.生物反應(yīng)器上培養(yǎng)T瓶的6×104cells/ml接種15ml,靜態(tài)培養(yǎng)3天后,開啟蠕動泵進行灌注培養(yǎng),連續(xù)灌注20天,每五天檢測一次廢液中葡萄糖、乳酸濃度,CCK-8計量細胞數(shù)。通過計算出葡萄糖消耗率、乳酸累計率及細胞數(shù)量,做出擬合曲線。 試驗結(jié)果:1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學(xué)觀察:骨髓間充質(zhì)干細胞接種后24h開始貼壁,隨著時間的延長貼壁細胞數(shù)量明顯增加,呈現(xiàn)梭形或多角形形態(tài),經(jīng)換液逐步將培養(yǎng)瓶中不貼壁的細胞清除;接種后4-5d可見較明顯的集落形成,集落的形態(tài)、大小、密度各不相同;約6-8d,貼壁細胞逐漸融合成單層,細胞多呈梭形,細胞排列呈現(xiàn)明顯的輻射狀、漩渦狀。 2.定向誘導(dǎo)為成骨細胞:在誘導(dǎo)3-4d后,骨髓間充質(zhì)干細胞逐漸變得扁平,由細長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槿切位蚨嘟切?8d時,培養(yǎng)細胞大部分變?yōu)槎嘟切?細胞外基質(zhì)分泌增多;第14d時,培養(yǎng)細胞之間出現(xiàn)黑色結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)。ALP活性較高,ALP和茜素紅染色大多數(shù)細胞成陽性。灌注培養(yǎng)后細胞與靜態(tài)培養(yǎng)細胞在成骨分化能力上沒有明顯差異。 3.定向誘導(dǎo)成脂肪細胞:在成脂肪誘導(dǎo)5d,細胞原來的多角形突觸逐漸回縮,但仍呈多角形;7-8d時出現(xiàn)明顯脂滴,脂滴多位于細胞邊緣;誘導(dǎo)14d后,脂肪細胞增加,細胞內(nèi)脂滴密布,多數(shù)細胞形態(tài)變圓,多散在分布。油紅0染色大部分細胞呈陽性。灌注培養(yǎng)后細胞與靜態(tài)培養(yǎng)細胞在成脂分化能力上沒有明顯差異。 4.實驗細胞數(shù)量范圍內(nèi),24孔板靜態(tài)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞數(shù)量與葡萄糖的消耗率成線性關(guān)系(R2=0.9684)葡萄糖的比細胞得率qG lu=1.84mg /106cells-d;24孔板靜態(tài)培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞數(shù)量與乳酸累計率( R2=0.9571),乳酸的比細胞得率q Lac=1.736mg /106cells-d 5.實驗細胞數(shù)量范圍內(nèi),生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)T瓶中骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)量可認為與葡萄糖的消耗率成線性關(guān)系(R2=0.9664)qG lu=1.66 mg/106cells-day;干細胞數(shù)量與乳酸累計率成線性關(guān)系(R2=0.9554) q Lac=1.61mg/106 cells-day。 2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在Dex、β-甘油磷酸鈉和維C作用下,可以向成骨細胞分化。灌注培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞和靜態(tài)培養(yǎng)的干細胞一樣具有相同成骨分化能力。 3.大鼠骨髓基質(zhì)干細胞在胰島素、Dex和IBMX誘導(dǎo)下,可以定向分化為脂肪細胞。灌注培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞和靜態(tài)培養(yǎng)的干細胞具有相同成脂分化能力。 4.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在自制生物反應(yīng)器中進行擴增,實驗細胞數(shù)量范圍內(nèi),葡萄糖消耗率、乳酸累計率與細胞數(shù)量成線性關(guān)系。
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【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2392653