【摘要】： 炎癥反應(yīng),包括急性炎癥和慢性炎癥的一個(gè)重要特征是白細(xì)胞在局部炎癥區(qū)域的過度聚集。幾乎任何改變細(xì)胞穩(wěn)定因素的刺激,都能誘導(dǎo)趨化因子的分泌,從而募集特定的白細(xì)胞到達(dá)炎癥區(qū)域,過度積聚的白細(xì)胞也會(huì)促進(jìn)產(chǎn)生過量的細(xì)胞因子,加劇細(xì)胞毒性反應(yīng),引發(fā)炎癥。在炎癥前期,病毒感染刺激因子激活體內(nèi)炎癥效應(yīng)細(xì)胞,產(chǎn)生大量趨化因子并引起炎性細(xì)胞的大量積聚,趨化因子高水平的持續(xù)不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá),也會(huì)使募集的白細(xì)胞大量增加形成破壞性的損傷,導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生。同時(shí),白細(xì)胞介導(dǎo)的損傷又使趨化因子高水平表達(dá)或使其他類型的趨化因子表達(dá)增加,產(chǎn)生進(jìn)一步的組織損傷,這樣使白細(xì)胞對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用被破壞而引起疾病。因而,針對(duì)趨化因子及其受體的抑制劑、拮抗劑有可能成為炎癥反應(yīng)治療的新的靶點(diǎn)。 本課題擬運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)從噬菌體肽庫(kù)中篩選與炎癥前期產(chǎn)生的相關(guān)趨化因子結(jié)合并可特異性阻斷趨化因子進(jìn)一步致炎作用的噬菌體克隆,近年來,隨著噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的不斷深入,它在炎癥反應(yīng)的研究中發(fā)揮的作用也越來越大。以炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的趨化因子為靶標(biāo),篩選得到與趨化因子具有高親和力的短肽,可以抑制炎癥感染前期產(chǎn)生的趨化因子,從而阻斷機(jī)體的炎癥反應(yīng),并且能克服常規(guī)大分子藥物的分子量大、組織滲透性弱、不穩(wěn)定、有免疫原性及體內(nèi)運(yùn)輸能力差的等缺點(diǎn),為炎癥反應(yīng)藥物的開發(fā)研究提供了新的方法。篩選得到的陽性克隆經(jīng)DNA序列測(cè)定、多肽的分析比較研究,確定其活性,再研究其對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用原理,為新型抗炎因子作用靶點(diǎn)的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。 篩選出的拮抗劑先導(dǎo)物對(duì)感染產(chǎn)生的細(xì)胞因子有抑制作用,從而阻斷機(jī)體的炎癥反應(yīng),而且一系列的藥效和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)都表明,廣譜趨化因子功能抑制劑不僅具有強(qiáng)大抗炎效果,而且相較于甾體類抗炎藥物有明顯的降低毒副反應(yīng)的作用,因此具有極其優(yōu)秀的開發(fā)應(yīng)用前景。 目的： 通過篩選出炎癥前期趨化因子的抑制劑先導(dǎo)物,對(duì)感染產(chǎn)生的炎癥相關(guān)趨化因子產(chǎn)生拮抗作用,從而阻斷機(jī)體的炎癥反應(yīng),為炎癥感染的防治探索新途徑。 研究方法： 1.常規(guī)方法抽提和培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞(PBMC),以的脂多糖(LPS)刺激PBMC建立體外急性炎癥模型,濃縮收集并分析上清液中趨化因子的產(chǎn)生情況。 2.利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)進(jìn)行親和篩選,獲得噬菌體陽性克隆。 3.將獲得的陽性噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序,應(yīng)用多種生物信息學(xué)軟件將多肽序列進(jìn)行比較分析,推導(dǎo)與炎性相關(guān)趨化因子廣譜結(jié)合的的小分子十二肽。 4.通過趨化抑制試驗(yàn)選擇抑制率高的克隆進(jìn)行合成并研究其活性； 5.對(duì)合成的短肽進(jìn)行MTT檢測(cè)和體外活性檢測(cè),研究其對(duì)炎性趨化因子的抑制情況； 6.利用鈣流試驗(yàn)檢測(cè)短肽是否與趨化因子受體有關(guān)； 7.根據(jù)廣譜趨化因子抑制劑的分子作用機(jī)制,采用RT-PCR試驗(yàn)檢測(cè)其mRNA水平的趨化因子表達(dá)情況,以研究短肽降低趨化因子表達(dá)的作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.經(jīng)過4輪噬菌體親和篩選,噬菌體克隆回收率從5.51×10-8增加到5.06×10-6,第四輪的回收率約是第一輪91.83倍,說明目標(biāo)噬菌體克隆得到了有效富集。 2.效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有16個(gè)克隆效價(jià)較高,瓊脂糖凝膠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中10個(gè)克隆的DNA處于相同的位置,條帶比較清晰,對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。 3.測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)克隆有相同的插入序列高概率短肽,命名為P1肽,另外5個(gè)同源性較差,利用PROTPARAM生物信息學(xué)軟件分析各條短肽的理化性質(zhì)等。 4.趨化抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),P1肽可顯著抑制急性炎癥模型中各類炎性趨化因子的表達(dá),其他短肽的抑制率并不理想,可以認(rèn)為它可能是炎性趨化因子抑制劑的基本骨架或者先導(dǎo)物。 5.根據(jù)短肽序列進(jìn)行生物合成,利用MTT試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)PBMC的活性影響,結(jié)果說明P1肽對(duì)PBMC細(xì)胞的活性并無影響。 6.通過LUMINEX芯片技術(shù)檢測(cè)P1肽對(duì)急性炎癥模型的趨化因子表達(dá)的影響情況,試驗(yàn)結(jié)果表明P1肽可以明顯降低各類炎癥相關(guān)趨化因子的表達(dá)。 7.鈣流試驗(yàn)結(jié)果表明P1肽可以有效抑制炎癥趨化因子與受體的結(jié)合概率,而且P1肽本身也不會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化,說明P1肽的趨化抑制作用與趨化因子受體并無明顯關(guān)系。 8.RT-PCR結(jié)果說明在P1肽的作用下,各類趨化因子的mRNA的表達(dá)均有明顯的降低,但是TTP的表達(dá)并無影響,說明趨化因子mRNA的降低表達(dá)并不是通過TTP來實(shí)現(xiàn)的,可能涉及到其他功能基因的表達(dá),這均有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證明。 結(jié)論： 1成功篩選得到可有效抑制趨化因子表達(dá)的十二短肽； 2活性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該短肽對(duì)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生毒副作用； 3作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)P1肽可以抑制各類炎癥相關(guān)趨化因子mRNA的表達(dá)進(jìn)而抑制趨化因子的量,但是其具體的抑制機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證明。
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【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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2 孫美艷;張磊;李艷;;噬菌體展示技術(shù)的研究進(jìn)展[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào);2009年02期

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4 李s，

本文編號(hào)：2392564