【摘要】： 目的:用免疫活性細(xì)胞輸注的過繼性細(xì)胞免疫療法(adoptive cell immunotherapy ACI)是腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)之一。此治療方法不僅是常規(guī)手術(shù)、放療、化療等抗腫瘤治療的補(bǔ)充,它對(duì)于促進(jìn)患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變等都有良好的效果。更為晚期不適于手術(shù)治療或無法承受放、化療所帶來的副作用的患者開辟了一個(gè)新的治療途徑,成為人類抗腫瘤治療最有希望的措施之一。 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CIK(cytokine induced killer,CIK),作為一種新型高效的免疫活性細(xì)胞因其具有增殖能力強(qiáng)、殺瘤譜廣、殺瘤活性強(qiáng)等其它一些效應(yīng)細(xì)胞無法比擬的優(yōu)越特性,在過繼性細(xì)胞免疫治療中得到了廣泛的應(yīng)用。如何提高CIK細(xì)胞的數(shù)量、增強(qiáng)其抗腫瘤殺傷活性以及抗腫瘤特異性等方面是目前針對(duì)于CIK細(xì)胞的研究關(guān)鍵。樹突狀細(xì)胞(DC)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的效力最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞,具有高效攝取、加工、遞呈腫瘤相關(guān)抗原,并激活初始免疫反應(yīng)的獨(dú)特功能。本實(shí)驗(yàn)利用DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng),并且負(fù)載特異性抗原,以便獲得數(shù)量更多、殺傷活性更高,更具有特異性的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。 但是在實(shí)際應(yīng)用過程中,抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中通常被誘導(dǎo)進(jìn)入"免疫無能"(immune anergy)狀態(tài),因此不能有效地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。去除體內(nèi)的免疫抑制細(xì)胞,充分發(fā)揮效應(yīng)細(xì)胞的功能,對(duì)于提高腫瘤的治療效果具有重要意義。CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的細(xì)胞群,目前較為常用的是根據(jù)產(chǎn)生的途徑不同將CD4~+CD25~+ T細(xì)胞分為自然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells nTreg)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(induced regulatory T cells iTreg)兩類。大量研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌癥患者的外周血、腫瘤浸潤(rùn)淋巴結(jié)中都可以檢測(cè)出CD4~+CD25~+T細(xì)胞,CD4~+CD25~+T細(xì)胞可能通過識(shí)別腫瘤抗原,活化后發(fā)揮其免疫抑制作用,抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生,使機(jī)體處于對(duì)腫瘤低應(yīng)答或無應(yīng)答的一種狀態(tài)。這些研究說明CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞對(duì)于腫瘤的免疫治療是一個(gè)重要的障礙。因此尋找既能增強(qiáng)免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+T細(xì)胞作用的方法,將為提高和改善腫瘤免疫治療提供一個(gè)嶄新的途徑。 本實(shí)驗(yàn)將特異性抗原致敏的成熟DC與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng),作為抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞,從形態(tài)學(xué)、對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性等不同方面觀察不同的階段應(yīng)用免疫磁珠分選去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原致敏的DC-CIK細(xì)胞對(duì)B16黑色素瘤動(dòng)物模型的作用,來探討和分析CIK細(xì)胞、Treg細(xì)胞在抗腫瘤免疫中所起的作用以及相互關(guān)系,來為抗腫瘤免疫治療的臨床應(yīng)用提供更多的治療思路和理論基礎(chǔ)。 方法: 本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠的黑色素瘤動(dòng)物模型作為研究對(duì)象,制備黑色素瘤動(dòng)物模型,并應(yīng)用放射性鈷60對(duì)小鼠黑色素瘤動(dòng)物模型進(jìn)行照射,使小鼠機(jī)體內(nèi)形成非髓性淋巴細(xì)胞刪除狀態(tài),使C57BL/6小鼠的黑色素瘤動(dòng)物模型的免疫機(jī)制喪失。 取小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)制備樹突狀細(xì)胞和CIK細(xì)胞,將兩者共同培養(yǎng),并且負(fù)載腫瘤特異性抗原,并檢測(cè)其免疫表型。以免疫磁珠分選方法分別在培養(yǎng)前及培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分。分別得到去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分再經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞、經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞,再用磁珠分選方法去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞和未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞共三組抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞。 然后再將制備好的達(dá)到非髓性淋巴細(xì)胞刪除狀態(tài)的C57BL/6小鼠的黑色素瘤動(dòng)物模型隨機(jī)分為4組。第一組:回輸先通過磁珠分選去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分再經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞,第二組:回輸先經(jīng)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞,再用磁珠分選方法去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞。第三組:回輸未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的DC-CIK細(xì)胞組。第四組:對(duì)照組。 通過測(cè)量各組的腫瘤體積、重量、計(jì)算抑瘤率,比較其抑瘤作用,并應(yīng)用透射電鏡觀察特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞及殺傷腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。應(yīng)用流氏細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞的增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比率、細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation Index,PI)和細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis Index ,AI)的變化,觀察特異性抗原負(fù)載的DC-CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 采用MTT染色法檢測(cè)培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組、培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組、未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組三組抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)B16黑色素瘤腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果: 采用特異性腫瘤抗原致敏的DC細(xì)胞與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng),分析其免疫表型,透射電鏡觀察特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞體積增大,核有切跡,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,細(xì)胞表面有突起,與腫瘤細(xì)胞密切接觸,大量腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死。 培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組腫瘤平均體積0.0377±0.0128cm3 ,培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組腫瘤平均體積0.0359±0.0131cm3,未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組腫瘤平均體積0.1278±0.0362 cm3,而對(duì)照組腫瘤平均體積0.4052±0.0429cm3。三組實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積均明顯小于對(duì)照組(P0.05),不同階段去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的兩組之間比較,雖然培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組較培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分組體積略小,但沒有顯著性差異(P 0.05)。但兩組與未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組比較腫瘤體積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 三組特異性抗原致敏的DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞組抑瘤率明顯高于對(duì)照組(P0.05);去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分兩組抑瘤率明顯高于未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞組(P0.05),但兩組之間沒有明顯差異(P 0.05)。 瘤體重量對(duì)照組3.361±1.07g,培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組0.958±0.32g,培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組0.939±0.41g,未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞組1.651±0.57g。同樣三實(shí)驗(yàn)組瘤體重量均明顯小于對(duì)照組(P0.05)。但不同階段去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的兩組腫瘤重量都小于未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分組,并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。不同階段去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分的兩組之間則沒有顯著性差異(P 0.05)。 透射電鏡可以觀察到特異性抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)的改變。流式細(xì)胞(FCM)檢測(cè)癌細(xì)胞增殖周期中的變化;實(shí)驗(yàn)組三組與對(duì)照組比較G0/G1期細(xì)胞比率、AI顯著升高,S期無明顯變化,G2/M期細(xì)胞比率、PI顯著下降;去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分兩組G0/G1期細(xì)胞比率、AI明顯高于未去除CD4~+CD25~+Treg組,G2/M期細(xì)胞比率、PI顯著低于未去除CD4~+CD25~+Treg組,S期無明顯變化。去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分兩組之間比較G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比率和AI、PI均沒有明顯差異(P 0.05)。 采用MTT法檢測(cè)培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組,培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組和未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組三組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于B16黑色素瘤細(xì)胞的殺傷作用,結(jié)果表明三組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞都有較強(qiáng)的殺傷作用。培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組和培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組對(duì)B16黑色素細(xì)胞的殺傷作用明顯高于(P0.05)未去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組。且不同效靶比之間比較,效靶比越高殺傷作用越強(qiáng)。培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組和培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞DC-CIK細(xì)胞組兩組之間比較對(duì)B16黑色素細(xì)胞的殺傷作用沒有顯著性差異(P 0.05)。 結(jié)論: 1、特異性抗原致敏的DC-CIK細(xì)胞對(duì)B16黑色素瘤具有明顯的抑瘤作用,并且對(duì)B16黑色素瘤的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用。特異性抗原致敏的DC-CIK細(xì)胞可以影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期,并且具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。說明CIK細(xì)胞是一種具有強(qiáng)大腫瘤殺傷能力的新一代過繼免疫抗腫瘤細(xì)胞。 2、去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞成分后的特異性抗原致敏的DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤免疫的作用更加高效而且特異,說明CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞能夠?qū)μ禺愋钥乖旅舻腄C-CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性形成明顯的抑制。去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞,重新募集效應(yīng)性T細(xì)胞能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤作用,這將成為一種可行的腫瘤免疫治療方法。 3、不同時(shí)段去除CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞后,從抑瘤作用、對(duì)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用上都有一定的差異,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞各個(gè)亞群的來源和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392;R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2391551