【摘要】： 目的:用免疫活性細胞輸注的過繼性細胞免疫療法(adoptive cell immunotherapy ACI)是腫瘤生物治療的研究熱點之一。此治療方法不僅是常規(guī)手術(shù)、放療、化療等抗腫瘤治療的補充,它對于促進患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變等都有良好的效果。更為晚期不適于手術(shù)治療或無法承受放、化療所帶來的副作用的患者開辟了一個新的治療途徑,成為人類抗腫瘤治療最有希望的措施之一。 細胞因子誘導的殺傷細胞CIK(cytokine induced killer,CIK),作為一種新型高效的免疫活性細胞因其具有增殖能力強、殺瘤譜廣、殺瘤活性強等其它一些效應細胞無法比擬的優(yōu)越特性,在過繼性細胞免疫治療中得到了廣泛的應用。如何提高CIK細胞的數(shù)量、增強其抗腫瘤殺傷活性以及抗腫瘤特異性等方面是目前針對于CIK細胞的研究關(guān)鍵。樹突狀細胞(DC)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的效力最強的抗原遞呈細胞,具有高效攝取、加工、遞呈腫瘤相關(guān)抗原,并激活初始免疫反應的獨特功能。本實驗利用DC細胞與CIK細胞共同培養(yǎng),并且負載特異性抗原,以便獲得數(shù)量更多、殺傷活性更高,更具有特異性的抗腫瘤效應細胞。 但是在實際應用過程中,抗腫瘤效應細胞在腫瘤微環(huán)境中通常被誘導進入"免疫無能"(immune anergy)狀態(tài),因此不能有效地識別和殺傷腫瘤細胞。去除體內(nèi)的免疫抑制細胞,充分發(fā)揮效應細胞的功能,對于提高腫瘤的治療效果具有重要意義。CD4~+CD25~+Treg細胞是新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的細胞群,目前較為常用的是根據(jù)產(chǎn)生的途徑不同將CD4~+CD25~+ T細胞分為自然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細胞(natural regulatory T cells nTreg)和誘導產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細胞(induced regulatory T cells iTreg)兩類。大量研究發(fā)現(xiàn)在胃癌、肺癌、乳腺癌等癌癥患者的外周血、腫瘤浸潤淋巴結(jié)中都可以檢測出CD4~+CD25~+T細胞,CD4~+CD25~+T細胞可能通過識別腫瘤抗原,活化后發(fā)揮其免疫抑制作用,抑制機體抗腫瘤免疫應答的產(chǎn)生,使機體處于對腫瘤低應答或無應答的一種狀態(tài)。這些研究說明CD4~+CD25~+Treg細胞對于腫瘤的免疫治療是一個重要的障礙。因此尋找既能增強免疫效應細胞的抗腫瘤作用又能抑制或清除CD4~+CD25~+T細胞作用的方法,將為提高和改善腫瘤免疫治療提供一個嶄新的途徑。 本實驗將特異性抗原致敏的成熟DC與CIK細胞共同培養(yǎng),作為抗腫瘤免疫效應細胞,從形態(tài)學、對細胞增殖和凋亡的影響以及對腫瘤細胞殺傷活性等不同方面觀察不同的階段應用免疫磁珠分選去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原致敏的DC-CIK細胞對B16黑色素瘤動物模型的作用,來探討和分析CIK細胞、Treg細胞在抗腫瘤免疫中所起的作用以及相互關(guān)系,來為抗腫瘤免疫治療的臨床應用提供更多的治療思路和理論基礎(chǔ)。 方法: 本實驗以C57BL/6小鼠的黑色素瘤動物模型作為研究對象,制備黑色素瘤動物模型,并應用放射性鈷60對小鼠黑色素瘤動物模型進行照射,使小鼠機體內(nèi)形成非髓性淋巴細胞刪除狀態(tài),使C57BL/6小鼠的黑色素瘤動物模型的免疫機制喪失。 取小鼠外周血單個核細胞(PBMC)制備樹突狀細胞和CIK細胞,將兩者共同培養(yǎng),并且負載腫瘤特異性抗原,并檢測其免疫表型。以免疫磁珠分選方法分別在培養(yǎng)前及培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分。分別得到去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分再經(jīng)體外誘導產(chǎn)生的特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞、經(jīng)體外誘導產(chǎn)生腫瘤特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞,再用磁珠分選方法去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞和未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞共三組抗腫瘤免疫效應細胞。 然后再將制備好的達到非髓性淋巴細胞刪除狀態(tài)的C57BL/6小鼠的黑色素瘤動物模型隨機分為4組。第一組:回輸先通過磁珠分選去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分再經(jīng)體外誘導產(chǎn)生的特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞,第二組:回輸先經(jīng)體外誘導產(chǎn)生腫瘤特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞,再用磁珠分選方法去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK效應細胞。第三組:回輸未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的DC-CIK細胞組。第四組:對照組。 通過測量各組的腫瘤體積、重量、計算抑瘤率,比較其抑瘤作用,并應用透射電鏡觀察特異性抗原負載的DC-CIK細胞及殺傷腫瘤細胞的形態(tài)學表現(xiàn)。應用流氏細胞技術(shù)(FCM)檢測各組腫瘤細胞的增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期細胞比率、細胞增殖指數(shù)(proliferation Index,PI)和細胞凋亡指數(shù)(apoptosis Index ,AI)的變化,觀察特異性抗原負載的DC-CIK對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響。 采用MTT染色法檢測培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組、培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組、未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組三組抗腫瘤免疫效應細胞對B16黑色素瘤腫瘤細胞的殺傷效應。 結(jié)果: 采用特異性腫瘤抗原致敏的DC細胞與CIK細胞共同培養(yǎng),分析其免疫表型,透射電鏡觀察特異性抗原負載的DC-CIK細胞體積增大,核有切跡,細胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,細胞表面有突起,與腫瘤細胞密切接觸,大量腫瘤細胞凋亡、壞死。 培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組腫瘤平均體積0.0377±0.0128cm3 ,培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組腫瘤平均體積0.0359±0.0131cm3,未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組腫瘤平均體積0.1278±0.0362 cm3,而對照組腫瘤平均體積0.4052±0.0429cm3。三組實驗組腫瘤體積均明顯小于對照組(P0.05),不同階段去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的兩組之間比較,雖然培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組較培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分組體積略小,但沒有顯著性差異(P 0.05)。但兩組與未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組比較腫瘤體積有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 三組特異性抗原致敏的DC-CIK效應細胞組抑瘤率明顯高于對照組(P0.05);去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分兩組抑瘤率明顯高于未去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK效應細胞組(P0.05),但兩組之間沒有明顯差異(P 0.05)。 瘤體重量對照組3.361±1.07g,培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組0.958±0.32g,培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組0.939±0.41g,未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的特異性抗原負載的DC-CIK細胞組1.651±0.57g。同樣三實驗組瘤體重量均明顯小于對照組(P0.05)。但不同階段去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的兩組腫瘤重量都小于未去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分組,并且有統(tǒng)計學差異(P0.05)。不同階段去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分的兩組之間則沒有顯著性差異(P 0.05)。 透射電鏡可以觀察到特異性抗原負載的DC-CIK細胞能促進腫瘤細胞凋亡超微結(jié)構(gòu)的改變。流式細胞(FCM)檢測癌細胞增殖周期中的變化;實驗組三組與對照組比較G0/G1期細胞比率、AI顯著升高,S期無明顯變化,G2/M期細胞比率、PI顯著下降;去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分兩組G0/G1期細胞比率、AI明顯高于未去除CD4~+CD25~+Treg組,G2/M期細胞比率、PI顯著低于未去除CD4~+CD25~+Treg組,S期無明顯變化。去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分兩組之間比較G0/G1期、S期、G2/M期細胞比率和AI、PI均沒有明顯差異(P 0.05)。 采用MTT法檢測培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組,培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組和未去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組三組效應細胞對于B16黑色素瘤細胞的殺傷作用,結(jié)果表明三組效應細胞對腫瘤細胞都有較強的殺傷作用。培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組和培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組對B16黑色素細胞的殺傷作用明顯高于(P0.05)未去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組。且不同效靶比之間比較,效靶比越高殺傷作用越強。培養(yǎng)前去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組和培養(yǎng)后去除CD4~+CD25~+Treg細胞DC-CIK細胞組兩組之間比較對B16黑色素細胞的殺傷作用沒有顯著性差異(P 0.05)。 結(jié)論: 1、特異性抗原致敏的DC-CIK細胞對B16黑色素瘤具有明顯的抑瘤作用,并且對B16黑色素瘤的腫瘤細胞有較強的殺傷作用。特異性抗原致敏的DC-CIK細胞可以影響腫瘤細胞的細胞周期,并且具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用。說明CIK細胞是一種具有強大腫瘤殺傷能力的新一代過繼免疫抗腫瘤細胞。 2、去除CD4~+CD25~+Treg細胞成分后的特異性抗原致敏的DC-CIK細胞抗腫瘤免疫的作用更加高效而且特異,說明CD4~+CD25~+Treg細胞能夠?qū)μ禺愋钥乖旅舻腄C-CIK細胞殺傷腫瘤細胞的活性形成明顯的抑制。去除CD4~+CD25~+Treg細胞,重新募集效應性T細胞能夠增強機體的抗腫瘤作用,這將成為一種可行的腫瘤免疫治療方法。 3、不同時段去除CD4~+CD25~+Treg細胞后,從抑瘤作用、對于腫瘤細胞的細胞周期的影響和對腫瘤細胞的殺傷作用上都有一定的差異,但沒有統(tǒng)計學意義,說明CD4~+CD25~+Treg細胞各個亞群的來源和作用機制還需要進一步的研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392;R730.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 陳復興,劉軍權(quán),張南征,鞏新建,張國龍,徐永茂,周忠海,王濤,黃健;自身細胞因子誘導的殺傷細胞過繼性免疫治療惡性腫瘤的臨床觀察[J];癌癥;2002年07期

2 童春容,耿彥彪,陸道培;自體細胞因子誘導的殺傷細胞治療急性白血病的臨床研究[J];北京醫(yī)科大學學報;2000年05期

3 謝遵江,賈立敏,賀業(yè)春,劉穎,劉麗;體外培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細胞的擴增、鑒定及形態(tài)學觀察[J];解剖科學進展;2005年03期

4 張宏文,彭曉,張曉燕;臍帶血DCs對CIK細胞殺傷活性的影響研究[J];臨床血液學雜志;2002年01期

5 任歡,邢淑賢,徐紅薇,宋英暉,商曉舟,周貴生,田景先,李殿俊;CIK的體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性的實驗研究[J];中國腫瘤生物治療雜志;1999年01期

6 張嵩,王恩忠,白春學,徐永華;共培養(yǎng)的樹突狀細胞與CIK細胞治療結(jié)腸癌血源性肺轉(zhuǎn)移的實驗研究[J];腫瘤;2003年06期

，

本文編號：2391551