【摘要】： Toll樣受體(toll-like receptor, TLRs)是近來發(fā)現(xiàn)的一類重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs),其不同程度地表達(dá)于淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞以及包括巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的單核吞噬細(xì)胞表面。TLRs能選擇性地識(shí)別侵入機(jī)體的病原微生物所攜帶的病原相關(guān)分子模式( pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。CpG-ODN(CpG-oligodexynucleotides)是來自細(xì)菌、病毒等病原體基因組的非甲基化核苷酸序列。CpG-ODN和LPS等PAMPs一樣,具有明確的活化天然免疫細(xì)胞的功能。人工合成的非甲基化的CpG-ODN可以在體外模擬細(xì)菌DNA作用,并主要通過TLRs9而發(fā)揮刺激細(xì)胞的作用,而且它可以作為瘤苗的佐劑。乳酸桿菌分泌物RNA作為一種PAMPs,其對免疫細(xì)胞的作用、是否也是通過TLRs或TLR9發(fā)揮刺激細(xì)胞的作用等都有待深入研究。 目的: 1.CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA單獨(dú)或聯(lián)合欖香烯復(fù)合瘤苗在體外刺激小鼠脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞增殖的影響,及對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。 2.CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA單獨(dú)或聯(lián)合欖香烯復(fù)合瘤苗在體外沖激的小鼠樹突狀細(xì)胞對YAC-1的殺傷作用及INF-γ分泌的影響。 3.不同處理的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞刺激全脾細(xì)胞增殖及對其NF-κB的表達(dá)的影響。 4.通過上述實(shí)驗(yàn)比較CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA對免疫細(xì)胞功能的影響觀察二者在功能上是否有相似性及比較二者作為瘤苗佐劑功能的相似性。 方法: 1.利用小鼠脾臟來源的DC與巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特性體外分離兩者,用MTT法測其增殖活性,中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)測巨噬細(xì)胞的吞噬功能。 2.用IL-4、GM-CSF誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞體外獲取BMDC,用MTT法測其增殖活性;混合淋巴反應(yīng)測其刺激全脾細(xì)胞增殖的能力,Western Blot法測不同處理的BMDC NF-κB的表達(dá)。 3.CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA單獨(dú)或聯(lián)合欖香烯復(fù)合瘤苗在體外分別刺激小鼠樹突狀細(xì)胞24小時(shí),收集DC及培養(yǎng)上清,用MTT法測不同處理的DC對YAC-1細(xì)胞的殺傷活性,用ELISA法測DC培養(yǎng)上清中INF-γ的濃度。 4.用倒置顯微鏡觀察DC形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果: 1.不同處理對小鼠免疫細(xì)胞增殖的變化: ①全脾細(xì)胞:CpG-ODN、CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA處理組對全脾細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用,單用瘤苗與乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗處理組對其生長有抑制作用;CpG-ODN處理組與其它各組差異顯著(P㩳0.05)。 ②巨噬細(xì)胞:用不同刺激物處理的脾臟巨噬細(xì)胞增殖能力與單純對照之間差異不顯著(P㧐0.05)。 ③脾臟來源的DC:CpG-ODN處理組和乳酸桿菌分泌物RNA處理組可促進(jìn)脾臟來源DC增殖,其余各組對其生長有抑制作用;CpG-ODN處理組和乳酸桿菌分泌物RNA處理組與單純對照和其他不同處理組的增殖指數(shù)之間差異顯著(P㩳0.05),其他組與對照之間差異不顯著(P㧐0.05)。 ④骨髓來源的DC:用不同刺激物的處理對BMDC生長有抑制作用,各組不同處理對BMDC生長抑制作用差異不顯著(P㧐0.05)。 2.中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)檢測不同處理對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響:不同的處理均可增加巨噬細(xì)胞的吞噬能力。各組不同處理的脾臟巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力與單純對照之間差異顯著( P㩳0.05),其中以CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物的OD值較其他處理組高。 3.不同處理的DC對小鼠YAC-1細(xì)胞的殺傷作用: ①脾臟來源的DC對小鼠YAC-1細(xì)胞的殺傷作用:按效靶比10:1,CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物對YAC-1細(xì)胞的殺傷率明顯高于單純對照組(P㩳0.05),以CpG-ODN+瘤苗溶解物組的殺傷率最高。其他各組之間差異不顯著(P㧐0.05)。 ②骨髓來源的DC對小鼠YAC-1細(xì)胞的殺傷作用:按效靶比10:1,經(jīng)不同處理的BMDC對小鼠YAC-1細(xì)胞的YAC-1細(xì)胞殺傷有抑制作用,除CpG-ODN+瘤苗溶解物處理組外,各組對YAC-1細(xì)胞的殺傷率與單純對照相比,明顯降低(P㩳0.05)。 4.不同抗原沖激的DC培養(yǎng)上清中INF-γ的濃度: ①脾臟來源DC培養(yǎng)上清中γ-INF的濃度:單純對照組為211.58±57.16 pg/ml,CpG-ODN組為456.00±31.68 pg/ml,瘤苗溶解物組為300.22±53.91 pg/ml,CpG-ODN+瘤苗溶解物組為563.44±36.77 pg/ml,乳酸桿菌分泌物RNA組為388.86±77.26 pg/ml,乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物組為781.00±76.42pg/ml。結(jié)果表明不同處理組與對照相比可促進(jìn)DC分泌γ-INF,各處理組與對照相比差異顯著(P㩳0.05)。 ②骨髓來源DC培養(yǎng)上清中γ-INF的濃度:單純對照組為1777.77±57.16 pg/ml , CpG-ODN組為1096.00±48.41 pg/ml ,瘤苗溶解物組為1256.70±52.61 pg/ml,CpG-ODN+瘤苗溶解物組為1043.17±41.25 pg/ml,乳酸桿菌分泌物RNA組為1249.98±54.56 pg/ml,乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物組為1313.11±43.91pg/ml。結(jié)果顯示各不同處理組與對照相比可抑制DC分泌INF-γ。 5.混合淋巴反應(yīng)測其刺激全脾細(xì)胞增殖的能力:用不同刺激物處理的BMDC均可刺激全脾細(xì)胞增殖,以CpG-ODN+瘤苗溶解物和乳酸桿菌分泌物RNA+瘤苗溶解物的OD值較其他處理組高。 6.不同處理的BMDC NF-κB的表達(dá)的影響:不同處理組與對照相比表達(dá)明顯上調(diào)。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA對全脾細(xì)胞和脾臟來源的DC增殖有促進(jìn)作用,對BMDC生長有抑制作用;它們不刺激巨噬細(xì)胞增殖但可以明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,并可加強(qiáng)瘤苗對巨噬細(xì)胞的作用。CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA沖激脾臟來源的DC可以增強(qiáng)其殺傷YAC-1的作用和促進(jìn)脾臟來源的DC分泌INF-γ,但相同條件下對BMDC的殺傷作用是抑制的,且與單純對照相比抑制BMDC分泌INF-γ,但其可以增加BMDC刺激全脾細(xì)胞的增殖和NF-κB的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:CpG-ODN與乳酸桿菌分泌物RNA在功能上有一定的相似性,并在某些方面可以加強(qiáng)腫瘤疫苗的作用。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2390143