【摘要】： 目的 1.克隆土撥鼠和旱獺CD4分子。制備多克隆,單克隆抗體,并對其特性進行初步鑒定。 2.建立小鼠和旱獺的淋巴細胞增殖試驗檢測方法,為wCD4抗體的動物實驗做準備。 方法 1.從土撥鼠PBMC中克隆CD4的cDNA序列,測序并比對分析wCD4和其它哺乳動物CD4的核苷酸、氨基酸同源性。 2.從中國旱獺PBMC中克隆CD4的cDNA序列,測序并比對分析wCD4和cwCD4序列同源性。 3.從旱獺肝組織或新鮮分離的PBMC中,用蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提的方法獲得DNA。PCR擴增旱獺細胞色素b基因進行種系發(fā)生分析。 4.實時熒光定量PCR檢測感染W(wǎng)HV的旱獺肝內(nèi)CD4的表達水平的變化。為以后的CD4抗體體內(nèi)試驗提供理論依據(jù)。 5.原核誘導表達純化wCD4蛋白,免疫兔子制備wCD4的多克隆抗體,鑒定抗體的效價和特異性。 6.原核表達純化的wCD4蛋白以Al(OH)3佐劑化,常規(guī)免疫Balb/c小鼠。通過細胞融合技術(shù)將小鼠骨髓瘤細胞SP2／0和免疫后的小鼠脾細胞融合,用免疫原蛋白包被板子經(jīng)ELISA方法進行初篩。經(jīng)真核表達質(zhì)粒CD4轉(zhuǎn)染BHK細胞后做免疫熒光復篩。得到的陽性克隆,通過三次有限稀釋法,篩選出穩(wěn)定分泌anti-wCD4的雜交瘤細胞。收集雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液,采用ELISA方法測定單克隆抗體Ig亞類。用雜交瘤細胞制備小鼠腹水。測定腹水和培養(yǎng)上清液中的抗體效價。將小鼠腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨純化。 7.采用ELISA, Western blot, IF對wCD4單克隆抗體進行特異性的鑒定。 8.用wCD4采用Western blot, IF, IHC的方法檢測旱獺PBMC和肝內(nèi)CD4+T淋巴細胞。 9.采用MTT法和CFSE法檢測小鼠脾細胞和旱獺PBMC細胞的增 結(jié)果 1.獲得土撥鼠CD4分子全長序列共1359bp,核苷酸序列與人、猩猩、兔、貓、豬、狗、小鼠、大鼠、鴨、雞的同源性分別為76.00%、75.33%、73.13%、72.39%、71.29%、71.15%、69.09%、69.31%、53.89%、52.79%。 2.獲得旱獺CD4胞外段序列,和土撥鼠CD4分子比對,核苷酸同源性99.6%。 3.通過種系發(fā)生分析,發(fā)現(xiàn)旱獺和土撥鼠高度同源。 4. RT-PCR法檢測旱獺WHV感染后,肝內(nèi)CD4 mRNA在感染后第二周有表達高峰。提示W(wǎng)HV感染后,CD4在早期就開始活化。為以后的動物實驗提供了CD4阻斷的時間點。 5.成功構(gòu)建土撥鼠CD4的原核表達載體,轉(zhuǎn)化BL21表達菌,經(jīng)過大量誘導表達純化獲得目的蛋白。用純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得高效價的特異性多克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA), Western blot,免疫熒光檢測,抗體的靈敏度和特異性均較高.為以后的單克隆抗體制備提供了篩選依據(jù)。 6.獲得四株可穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的細胞,命名為G1；G2；C9；C10。所分泌單克隆抗體均屬IgG1亞類。經(jīng)持續(xù)6個月培養(yǎng),低血清適應以及反復凍存與復蘇后,仍能保持其穩(wěn)定的細胞增殖和抗體分泌能力。細胞培養(yǎng)上清中抗體效價為103-104,腹水中抗體效價為107-108。 7.采用Western blot, IF的方法,該四株單克隆抗體均能識別真核表達質(zhì)粒PcDNA3.1-wCD4轉(zhuǎn)染BHK后表達的wCD4分子。因為該四株抗體都可以用于WBIF的檢測,所以推斷該四株抗體識別的應為CD4分子天然構(gòu)象中的線性表位。 8.采用IF, IHC的方法,該四株抗體均能識別旱獺PBMC中的CD4+T細胞。 9.采用IHC的方法,發(fā)現(xiàn)旱獺WHV感染后,第五周肝內(nèi)CD4+T細胞細胞浸潤明顯增加。 10.成功建立小鼠和旱獺流式檢測細胞增值試驗的方法。為以后的動物實驗奠定了基礎(chǔ)。 結(jié)論 1.成功克隆出土撥鼠CD4全長和旱獺CD4部分序列,經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)他們的同源性99.6%。旱獺種系發(fā)生分析結(jié)果顯示中國旱獺和土撥鼠高度同源。為進一步在土撥鼠、旱獺動物模型中研究WHV和免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 2.成功制備了特異性的高效價抗woodchuck CD4多克隆抗體。該多克隆抗體可以檢測到真核表達質(zhì)粒PcDNA3.1-wCD4轉(zhuǎn)染BHK后細胞表面表達的wCD4.為下一步的單抗篩選奠定基礎(chǔ)。 3.成功制備了四株能分泌抗土撥鼠CD4的單克隆抗體的雜交瘤細胞。該四株單抗均能識別轉(zhuǎn)染表達的土撥鼠CD4分子。該四株單抗均能識別旱獺PBMC的CD4+T細胞。 4.通過實時定量PCR的方法和wCD4單抗免疫組化的方法均檢測到旱獺感染早期,CD4+T細胞在肝內(nèi)開始活化增殖。為以后的CD4體內(nèi)阻斷試驗提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392.1

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本文編號：2387496