【摘要】： 第一部分HPC通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平發(fā)揮抗炎效應(yīng) 缺氧預(yù)處理(Hypoxia Preconditioning, HPC)是近年對缺氧病理生理機(jī)制研究比較集中的熱點之一。目前,缺氧預(yù)處理被認(rèn)為是一個復(fù)雜的,涉及多因素、多機(jī)制的保護(hù)過程。 最近有研究提示環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)與缺氧預(yù)處理時細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。cAMP是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多活動。細(xì)胞內(nèi)的cAMP處于一個動態(tài)平衡,胞外刺激可以通過細(xì)胞膜上G蛋白耦聯(lián)受體(G protein coupled recptors, GPCRs)如腎上腺素受體、腺苷受體(A2A及A2B受體)等激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase, AC),催化5’-AMP環(huán)化形成cAMP;一旦cAMP達(dá)到一定的水平,負(fù)反饋機(jī)制便自動啟動,主要通過兩條途徑:一是通過β-arrestin使GPCRs失活,減少cAMP的生成,二是通過磷酸二酯酶(PDEs)的作用將其降解為5’-AMP。 研究目的 本研究利用所在實驗室已建立的缺氧預(yù)處理動物及細(xì)胞模型,探討:1.缺氧預(yù)處理對細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的調(diào)節(jié)機(jī)制;2.cAMP信號通路參與缺氧預(yù)處理抗炎作用的機(jī)制。 實驗方法和材料 一、細(xì)胞缺氧預(yù)處理模型: 細(xì)胞置于低氧密閉容器(2%O2)中缺氧45分鐘,取出于正常氧環(huán)境(21%O2)中復(fù)氧20分鐘,此為一個循環(huán),重復(fù)3個循環(huán)。單純?nèi)毖踅M一直置于低氧密閉容器(2%O2)中,正常對照組則一直置于正常氧環(huán)境(21%O2)中。 二、動物缺氧預(yù)處理模型: C57BL/6小鼠或CD73基因缺陷小鼠隨機(jī)分成3組,分別是正常對照組、單純?nèi)毖踅M和缺氧預(yù)處理組。缺氧預(yù)處理組小鼠被放置于可調(diào)節(jié)氧濃度的濕化密閉容器內(nèi),調(diào)節(jié)氧濃度到8%,維持10分鐘,然后氧濃度轉(zhuǎn)換為21%持續(xù)10min,如此循環(huán)3次。然后取出,置于常氧環(huán)境中2小時;單純?nèi)毖踅M小鼠也被放置同種容器內(nèi),調(diào)節(jié)氧濃度到8%,維持1小時,取出,置于常氧環(huán)境中2小時;正常對照組小鼠在正常氧環(huán)境中(氧濃度21%),不作任何處理。隨后各組的小鼠均被置于容器內(nèi),調(diào)節(jié)氧濃度到5%,維持10分鐘,令其死亡,手術(shù)取出肺組織,立即投入液氮快速冷凍,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?三、缺氧預(yù)處理對cAMP水平及效應(yīng)的調(diào)節(jié): 1、ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP水平 2、Western blot方法檢測β-arrestin、PDE4B、p38MAPK等蛋白表達(dá)水平的變化 ①細(xì)胞總蛋白提取法:常規(guī)總蛋白裂解液提取 ②細(xì)胞蛋白分步提取法(兩步法):第一步提取胞漿/胞膜蛋白;第二步提取脂質(zhì)體/核蛋白 3、雙熒光素酶報告分析(Dual luciferase reporter assay)檢測NF-кB活性:將構(gòu)建有l(wèi)uciferase reporter的NFкB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞,在缺氧預(yù)處理后,繼續(xù)缺氧24小時,然后檢測Luciferase強(qiáng)度,即NFкB活性。 4、RT-PCR檢測PDE4B、白介素-6(IL-6)的mRNA水平 5、免疫熒光染色檢測NFкB的核移位情況 研究結(jié)果 一、缺氧預(yù)處理可以明顯提高Calu-3細(xì)胞和T84細(xì)胞內(nèi)cAMP水平:ELISA檢測顯示,與單純?nèi)毖踅M和正常氧環(huán)境組比,缺氧預(yù)處理組cAMP水平明顯提高。 二、缺氧預(yù)處理不影響細(xì)胞內(nèi)β-arrestin蛋白總量,但可使位于脂質(zhì)體上的“有效”β-arrestin減少,阻止GPCRs的失活,從而使cAMP生成增多。 三、缺氧預(yù)處理可降低PDE4B的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平,減少cAMP的降解。 四、缺氧預(yù)處理能抑制cAMP-PKA-CREB通路下游的p38MAPK的磷酸化。 五、缺氧預(yù)處理能抑制NF-кB的核移位。 六、缺氧預(yù)處理能抑制NF-кB的轉(zhuǎn)錄活性。 七、缺氧預(yù)處理能阻止IL-6 mRNA水平的升高。 結(jié)論 一、缺氧預(yù)處理可提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平:缺氧預(yù)處理一方面可以通過細(xì)胞外刺激信號如腺苷酸等的增強(qiáng),激活腺苷酸環(huán)化酶;另一方面可通過對β-arrestin和PDE4B的調(diào)節(jié),抑制負(fù)反饋途徑,共同促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP的提升。 二、缺氧預(yù)處理對cAMP的提升,可通過cAMP-PKA-CREB-p38MAPK通路,抑制NF-кB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 第二部分IκBα的SUMO化修飾參與HPC對NF-κB炎癥通路的抑制 SUMO化修飾是蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾的一種方式,是指小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-ralated modifier,SUMO)共價結(jié)合于靶蛋白的賴氨酸殘基上。這個過程類似但又不同于泛素化,與泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解不同,SUMO化修飾的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。SUMO參與了廣泛的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑,在蛋白-蛋白之間的相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核質(zhì)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面均發(fā)揮著重要的作用。 缺氧預(yù)處理是目前對缺氧病理生理機(jī)制研究的熱點之一,主要指在進(jìn)行缺氧處理以前,對研究對象給予幾次時間較短,程度較輕的“低氧-復(fù)氧-低氧-復(fù)氧”預(yù)適應(yīng)處理。缺氧預(yù)處理是一個復(fù)雜的,涉及多因素、多機(jī)制的保護(hù)過程,其中,對NF-кB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制是一個比較重要的環(huán)節(jié)。 有研究發(fā)現(xiàn)SUMO化修飾可阻止IκBα泛素化,從而抑制IκBα的降解,穩(wěn)定NF-κB,減輕炎癥反應(yīng)。我們推測,IκBα的SUMO化修飾可能參與缺氧預(yù)處理對NF-κB炎癥通路的抑制。 研究目的 本研究利用所在實驗室已建立的缺氧及缺氧預(yù)處理動物及細(xì)胞模型,探討IκBα的SUMO化修飾是否參與缺氧預(yù)處理對NF-κB炎癥通路的抑制。 實驗方法 一、細(xì)胞缺氧預(yù)處理模型:(方法同第一章) 二、動物缺氧預(yù)處理模型:(方法同第一章) 三、在Hela細(xì)胞模型中,利用SAE-1過表達(dá)上調(diào)SUMO-1水平,然后進(jìn)行缺氧預(yù)處理實驗,與正常對照組對比研究: 1、Western blot方法檢測IκBα、SUMO-1-IκBα、pIκBα等蛋白表達(dá)的變化。 2、雙熒光素酶報告法檢測NF-кB活性。 3、RT-PCR檢測IL-6 mRNA水平。 四、在Hela細(xì)胞模型中,利用shRNA下調(diào)SUMO-1水平,然后進(jìn)行缺氧預(yù)處理實驗,與正常組對比研究: 1、雙熒光素酶報告法分析檢測NF-кB活性。 2、RT-PCR檢測IL-6 mRNA水平 研究結(jié)果 小鼠模型中,缺氧預(yù)處理可以上調(diào)肺組織內(nèi)SUMO-1修飾的IκBα水平。 Hela細(xì)胞體外實驗中,缺氧可下調(diào)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SUMO-1修飾的IκBα水平,且呈時間依賴性;反之,缺氧預(yù)處理可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SUMO-1修飾的IκBα水平。SAE-1過表達(dá)可以阻止缺氧時IκBα的磷酸化及降解。SAE-1過表達(dá)可以阻止缺氧時NF-кB由胞漿到胞核的移位。SAE-1過表達(dá)可以阻止缺氧時NF-кB轉(zhuǎn)錄活性的升高。SAE-1過表達(dá)可以阻止缺氧時IL-6 mRNA水平的升高。SUMO-1 shRNA可減弱缺氧預(yù)處理對NF-кB核移位的抑制。SUMO-1 shRNA可減弱缺氧預(yù)處理對NF-кB轉(zhuǎn)錄活性的抑SUMO-1 shRNA可減弱缺氧預(yù)處理對IL-6 mRNA水平的抑制。 結(jié)論 一、缺氧預(yù)處理可以上調(diào)SUMO-1修飾的IκBα水平。 二、SAE-1過表達(dá)可以阻止缺氧時IκBα的磷酸化及降解,進(jìn)而抑制NF-кB炎癥通路,起到類似于缺氧預(yù)處理的保護(hù)作用。 三、SUMO-1的沉默則可減弱缺氧預(yù)處理對NF-кB炎癥通路的抑制,即削弱缺氧預(yù)處理的保護(hù)作用。簡而言之,IκBα的SUMO化修飾在缺氧預(yù)處理對細(xì)胞內(nèi)NF-кB炎癥通路的抑制過程中起重要作用。 第三部分IκBα的SUMO化修飾受腺苷相關(guān)通路的調(diào)節(jié) 腺苷(Adenosine,Ado)是核苷(Nucleotide)的一種,除參與能量代謝外,還在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的扮演重要角色:腺苷可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,通過G蛋白,參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)活動,包括對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。 研究發(fā)現(xiàn),腺苷與缺氧預(yù)處理(Hypoxia Preconditioning, HPC)關(guān)系密切。缺氧預(yù)處理是目前對缺氧病理生理機(jī)制研究的熱點之一,主要指在進(jìn)行缺氧處理以前,對研究對象給予幾次時間較短,程度較輕的“低氧-復(fù)氧-低氧-復(fù)氧”預(yù)適應(yīng)處理。缺氧預(yù)處理是一個復(fù)雜的,涉及多因素、多機(jī)制的保護(hù)過程,其中,對NF-кB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抑制是一個比較重要的環(huán)節(jié)。 缺氧預(yù)處理可以通過腺苷介導(dǎo)的Cullin-1 deneddylation,阻止IκBα的降解,穩(wěn)定NF-κB,從而阻斷其下游炎癥反應(yīng)。SUMO化修飾也可以阻止IκBα泛素化,從而抑制IκBα的降解,穩(wěn)定NF-κB,減輕炎癥反應(yīng)。從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度來看,處于上游的腺苷對下游的NF-κB炎癥通路的調(diào)節(jié)應(yīng)該是多途徑的。我們推測,IκBα的SUMO化修飾可能也是其中重要的一條,換言之,IκBα的SUMO化修飾可能也是腺苷介導(dǎo)的抗炎通路之一。 研究目的 本研究利用所在實驗室已建立的缺氧及缺氧預(yù)處理動物及細(xì)胞模型,探討IκBα的SUMO化修飾與腺苷通路的關(guān)系。 實驗方法 一、細(xì)胞缺氧預(yù)處理模型:(方法同第一章) 二、動物缺氧預(yù)處理模型:(方法同第一章) 三、在Hela細(xì)胞模型中,利用腺苷擬似劑NECA及阻斷劑8-PT對腺苷通路進(jìn)行激活/阻斷實驗,然后與正常對照組進(jìn)行以下對比研究: 1、正常氧環(huán)境下,激活/阻斷腺苷通路后,SUMO-1-IκBα結(jié)合蛋白水平的變化(Western blot方法檢測)。 2、缺氧環(huán)境下,激活/阻斷腺苷通路后,SUMO-1-IκBα結(jié)合蛋白水平的變化(Western blot方法檢測)。 四、過表達(dá)A2AR和A2BR,然后與野生型及陰性對照組比較SUMO-1-IκBα結(jié)合蛋白水平的變化。 五、動物實驗中阻斷腺苷通路:敲除小鼠CD73基因(內(nèi)源性腺苷生成中的關(guān)鍵基因),然后進(jìn)行缺氧預(yù)處理實驗,對比研究,SUMO-1- IκBα結(jié)合蛋白水平在阻斷前、后的變化。 六、在Hela細(xì)胞模型中,利用shRNA下調(diào)SUMO-1水平,然后進(jìn)行缺氧預(yù)處理實驗,雙熒光素酶報告法分析檢測NF-кB活性,對比研究SUMO-1水平變化對腺苷通路介導(dǎo)的抗炎作用的影響。 研究結(jié)果 在正常氧環(huán)境中,添加外源性腺苷可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SUMO-1- IκBα結(jié)合蛋白水平,且呈劑量依賴性。 在缺氧環(huán)境中,添加外源性腺苷仍然可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SUMO-1-IκBα結(jié)合蛋白水平,且呈劑量依賴性。 在正常氧和缺氧環(huán)境中,外源性腺苷上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SUMO-1- IκBα結(jié)合蛋白水平的作用均可被腺苷受體阻斷劑8-PT抑制。 過表達(dá)A2AR和A2BR,可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SUMO-1-IκBα結(jié)合蛋白水平。 小鼠CD73基因敲除后(CD73-/-),SUMO-1-IκBα結(jié)合蛋白水平明顯降低。 SUMO-1的沉默可以使外源性腺苷失去對NF-кB活性的抑制作用。 結(jié)論 通過以上研究,我們發(fā)現(xiàn):IκBα的SUMO化修飾受到腺苷相關(guān)通路的調(diào)節(jié)。缺氧預(yù)處理可以通過腺苷相關(guān)通路,促進(jìn)IκBα的SUMO化修飾,穩(wěn)定NF-кB,并因此抑制缺氧時細(xì)胞內(nèi)NF-кB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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本文編號：2380837