【摘要】： 實驗背景和目的 近年來磁場的作用逐漸受到人們的重視,它是一種安全有效的物理治療手段,在治療骨關(guān)節(jié)等疾病方面已經(jīng)取得了良好的療效,早有報道證明體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞以及牛主動脈內(nèi)皮細胞的血管形成可以被脈沖磁場有效地促進,FGF-2的分泌也同樣可以被磁場所促進,因此人們不斷尋找一種利用磁場這種無創(chuàng)療法改善心血管疾病的途徑。近年來缺血性心臟病的發(fā)病率逐年上升,而治療缺血性心臟病的主要手段就是促進內(nèi)皮的再生,進一步使新的血管形成。微血管內(nèi)皮細胞在功能上有許多與內(nèi)皮細胞相似的地方,它可以參與血管的再生,是心臟的一個重要組成部分,對改善心血管疾病起到重要的作用。但是現(xiàn)在對于這方面的研究很少,我們只能在探索中前進,尋找磁場發(fā)揮生物學效應(yīng)的最佳波形,強度以及時間,使磁場在治療心血管疾病上邁出一大步,為其在臨床的早日應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 實驗方法 實驗一不同波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響 1.心肌微血管內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng),利用胰酶以及膠原酶消化法培養(yǎng),用差速貼壁原理純化細胞。 2.實驗分為兩個大組:矩形波組以及三角波形磁場組,每大組又分為對照組和處理組,每個處理組內(nèi)各分為0.6mT、1.2mT、1.8mT和2.4mT四個磁場強度照射組。對照組不接受磁場輻照,其他條件輻照組均與磁場輻照組相一致。各磁場輻照組的心肌微血管內(nèi)皮細胞均于第一次傳代在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間后鏡下觀察見細胞貼壁時開始接受磁場輻照,選用脈沖磁場頻率為15Hz,輻照時間為4h/d,連續(xù)照射5d。CCK-8法檢測細胞增殖情況,transwell小室法檢測細胞遷移情況,流式細胞儀測定細胞各周期的變化,Hoechst33258染色鑒定細胞凋亡狀況,FITC標記的鬼筆環(huán)肽對細胞骨架染色,硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)液中NO含量的變化。 實驗二三角波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和細胞周期的影響 1.胰酶和膠原酶消化法培養(yǎng)原代的心肌微血管內(nèi)皮細胞,差速貼壁法純化細胞。 2.取心肌微血管內(nèi)皮2代細胞,將其分為4個組:即對照組、1.0mT組、1.4mT組和1.8mT組。對照組的細胞不曝磁,其他條件均與1.0mT、1.4mT及1.8mT組一致。1.0mT、1.4mT及1.8mT組的CMECs均于傳代后,鏡下觀察見細胞開始貼壁時,接受曝磁,以頻率為15 Hz的脈沖磁場刺激4 h/d,連續(xù)照射3 d。MTT法檢測細胞增殖活性,transwell小室法檢測細胞遷移情況,流式細胞儀測定細胞各周期的變化。 實驗結(jié)果 實驗一不同波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的影響 1.成功培養(yǎng)出原代心肌微血管內(nèi)皮細胞并成功純化。 2.矩形波作用后經(jīng)CCK-8檢測顯示4個磁場強度作用后與對照組相比細胞增殖水平均有提高,其中以1.8mT組增殖最為明顯(0.9679±0.057 vs 0.7552±0.0334;P0.01)。三角形波干預(yù)后0.6mT組與1.8mT組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),1.2mT組與2.4mT組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.矩形波輻照CMECs的遷移加快,各組遷移的細胞數(shù)(個/視野)與對照組比較均有顯著增多,其中以1.8mT組磁場強度作用最為明顯(48.00±4.18 vs 23.80±3.11,P0.01)。三角波0.6mT組和1.8mT組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),1.2mT組與2.4mT組與對照組相比沒有明顯增多(P0.05)。 4.經(jīng)流式細胞儀檢測,細胞經(jīng)矩形波輻照后,各組與對照組比較細胞各周期(G1期,S期以及G2期)均有明顯變化,(G2+S)期的細胞明顯增多, (P0.01),其中以1.8mT組變化最為顯著。經(jīng)三角波輻照后1.8mT組和0.6mT組對周期均有一定的影響(P0.05),1.2mT組和2.4mT組與對照組相比細胞周期幾乎沒有變化(P0.05)。 5.在熒光顯微鏡下觀察,矩形波輻照后各組凋亡率均有減低(P0.05)。三角波輻照后0.6mT組和1.8mT組凋亡率同樣減低(P0.05),1.2mT組和2.4mT組凋亡率與對照組相比無明顯差異(2.18±0.19 vs 2.30±0.35;2.24±0.27 vs 2.30±0.35;P0.05)。 6.經(jīng)矩形波輻照后細胞與對照組比較細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了重組,鏡下觀察見綠色熒光示經(jīng)FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色的細胞骨架,紅色熒光為經(jīng)碘化吡啶(PI)染色的細胞核,經(jīng)矩形波磁場輻照后各組的熒光染色強度均增加,細胞膜下的應(yīng)力纖維增多,聚集形成了綠色束樣結(jié)構(gòu),肌動蛋白清晰可見,其中0.6mT組以及1.8mT組變化最為顯著,三角波輻照后0.6mT和1.8mT亦有相同表現(xiàn)。 7.經(jīng)矩形波輻照5d后,NO分泌能力測定顯示,與對照組相比,各組NO分泌能力均有明顯提高(P0.01)。經(jīng)三角波輻照后,0.6mT組與1.8mT組與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05),1.2mT組與2.4mT組與對照組相比NO分泌能力未見明顯提高(P0.05)。 實驗二三角波形低頻脈沖磁場對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和細胞周期的影響 1.用MTT比色法測定表明,1.4mT組和1.8mT組CMECs的增殖能力與對照組相比有顯著提高(P0.05);而1.0mT組經(jīng)磁場輻照后,細胞增殖與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2. transwell小室法檢測細胞遷移能力,細胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后,顯微鏡(×200)下觀察計數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計學分析可見,磁場能夠促進CMECs遷移。1.4mT組和1.8mT組遷移的細胞數(shù)(個/視野)與對照組比較差異顯著(P0.05),1.0mT組與對照組相比無明顯差異(P0.05)。 3.流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示,細胞經(jīng)3 d曝磁后,1.4mT組和1.8mT組與對照組比較細胞各周期(G1期、S期和G2期)均有統(tǒng)計學意義,細胞處于增殖分化期的數(shù)量明顯增多,其中1.8mT的組變化最為顯著(P0.05)。 結(jié)論 在固定頻率下,大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的增殖、細胞周期、凋亡、遷移、細胞骨架以及NO分泌能力等生物學效應(yīng)與低頻脈沖磁場強度以及磁場的波形都是密切相關(guān)的,改變其中任何一個條件都會造成生物學效應(yīng)的改變。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R35

【參考文獻】

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本文編號：2380564