【摘要】：副溶血弧菌是一種廣泛存在于水環(huán)境中的一種導(dǎo)致人類和水生動物發(fā)生疾病的一種致病菌。在本研究中,我們建立了一種基于基因芯片和基于基因工程單鏈抗體的融合蛋白的檢測方法,對副溶血弧菌進(jìn)行檢測。 以副溶血弧菌的基因組的特征性基因為出發(fā)點,利用副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因(tlh)上的367 bp的片段檢測TLH,耐熱溶血毒素基因(tdh)上269 bp的片段檢測TDH,鞭毛蛋白編碼基因(FlaB)上的176 bp的片段檢測FLAB,利用Bio-dUTP標(biāo)記的液相三重PCR產(chǎn)物與特異探針(引物)的雜交,結(jié)合堿性磷酸酶檢測系統(tǒng),應(yīng)用基因芯片技術(shù)同步檢測副溶血弧菌的三個特有基因。實驗中,使用了36份的實際樣品對該檢測體系作了進(jìn)一步的驗證分析,在檢測的18株副溶血弧菌中,檢測到有8株是強(qiáng)毒株,10株是弱毒株,這與實際的結(jié)果相符合。在檢測的18株其他細(xì)菌中,均未發(fā)現(xiàn)任何的非特異性條帶,這與實際的結(jié)果也是一致的。 通過PCR擴(kuò)增副溶血弧菌基因組中的約1.3 kb的tlh抗原基因,利用基因工程技術(shù),構(gòu)建了pET32a-tlh載體,將抗原基因與硫氧還原蛋白基因進(jìn)行融合,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳分析表明有一條與預(yù)測分子量大小相一致的目的條帶,表達(dá)量約占菌體蛋白的45%左右,蛋白的可溶性高。融合蛋白末端的Trx標(biāo)簽增加蛋白的可溶性,His6標(biāo)簽有利于蛋白質(zhì)的純化。 用純化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,經(jīng)過加強(qiáng)免疫后測定小鼠的抗血清效價,達(dá)到一定的效價后,從小鼠的脾臟中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈,通過PCR擴(kuò)增得到重鏈可變區(qū)V_H和輕鏈可變區(qū)V_L基因,組裝成scFv并克隆到噬菌體載體pCANTAB-5E中,構(gòu)建噬菌體抗體庫。通過噬菌體展示技術(shù)淘選得到一株高親和力的單鏈抗體WW6。
[Abstract]:Vibrio parahaemolyticus (Vibrio parahaemolyticus) is a pathogen that causes diseases in human and aquatic animals. In this study, we developed a method for detection of vibrio parahaemolyticus based on gene chip and genetic engineering scFv. Based on the characteristic genes of the genome of Vibrio parahaemolyticus, the 367 bp fragment of the thermostable hemolytic toxin gene (tlh) of Vibrio parahaemolyticus was used to detect the 269 bp fragment of the TLH, heat resistant hemolytic toxin gene (tdh) for TDH, detection. Detection of 176 bp fragment on flagellin encoding gene (FlaB) FLAB, used Bio-dUTP labeled liquid phase triple PCR products hybridization with specific probes (primers), combined with alkaline phosphatase detection system. Three unique genes of Vibrio parahaemolyticus were detected by gene chip technique. In the experiment, 36 actual samples were used to further verify and analyze the detection system. Of the 18 strains of Vibrio parahaemolyticus detected, 8 were virulent strains and 10 were attenuated strains, which was consistent with the actual results. No nonspecific bands were found in the 18 other bacteria tested, which is consistent with the actual results. About 1.3 kb tlh antigen gene in the genome of Vibrio parahaemolyticus was amplified by PCR. The pET32a-tlh vector was constructed by genetic engineering technique, and the antigenic gene was fused with thioxy-reducing protein gene. SDS-PAGE gel electrophoresis analysis showed that there was a target band which was consistent with the predicted molecular weight of E. coli. The expression level was about 45% of the bacterial protein and the soluble protein was high. The Trx tag at the end of the fusion protein increased the solubility of the protein, and the His6 tag was helpful to the purification of the protein. Balb/c mice were immunized with purified protein. The titer of antiserum was determined after enhanced immunization, and the total RNA, reverse transcriptase was extracted from the spleen of the mice to obtain the first chain of cDNA. The V _ (th) gene in the heavy chain variable region and the V _ (L) L gene in the light chain variable region were obtained by PCR amplification. The scFv was assembled and cloned into the phage display vector pCANTAB-5E to construct the phage antibody library. High affinity scFv WW6. obtained by phage display technique
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃上媛，劉永福，周志江，張維國;脲酶陽性副溶血弧菌的臨床及實驗研究[J];中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志;1995年02期

2 李研東;盧士英;任洪林;周玉;柳增善;;副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表達(dá)[J];中國實驗診斷學(xué);2009年05期

3 王春宴,王茵茵,虞麗琴;抗副溶血弧菌鞭毛血清的初步研究[J];上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1998年09期

4 曹嚴(yán)華;日本1996～1998年的副溶血弧菌感染[J];疾病監(jiān)測;2000年10期

5 邱波,姚斐,王本利;產(chǎn)尿素酶副溶血弧菌的病原學(xué)研究[J];職業(yè)與健康;2003年05期

6 ;副溶血弧菌質(zhì)粒檢測[J];上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1994年06期

7 楊其元，劉均鳳，，孫天梅，李士永，崔樹玉;尿酶陽性副溶血弧菌的分離與鑒定[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;1996年01期

8 宋衛(wèi)峰;;副溶血弧菌基因組序列[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊);2003年06期

9 吳永生;劉思國;何浩;王春來;宮強(qiáng);彭永剛;王牟平;羅公平;魏鳳祥;孔憲剛;;金色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌和副溶血弧菌單管多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2006年04期

10 胡祺;;副溶血弧菌性肺炎[J];國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志;1984年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 趙峰;曹慧慧;周德慶;;東部六個沿海城市零售貝類中副溶血弧菌的分布及特征研究[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第七屆年會論文摘要集[C];2010年

2 陳文炳;李壽崧;邵碧英;江樹勛;;多重PCR技術(shù)在SARS病毒檢測中的應(yīng)用[A];中國的遺傳學(xué)研究——中國遺傳學(xué)會第七次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2003年

3 柯碧霞;譚海玲;李柏生;何冬梅;馬聰;劉美真;陳經(jīng)雕;;2009年廣東省副溶血弧菌暴發(fā)與散發(fā)菌株的病原學(xué)特征分析[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2011年

4 何麗斌;周宸;林克冰;;幾種養(yǎng)殖貝類中副溶血弧菌的分離與鑒定[A];第三屆全國現(xiàn)代生態(tài)漁業(yè)管理與技術(shù)研究[C];2011年

5 王昆;王棟;李魁英;張峰;馬書林;吳占軍;張新同;陳景順;;利用多重PCR技術(shù)鑒別牛早期胚胎性別研究[A];第三屆中國奶牛發(fā)展大會論文集[C];2008年

6 林強(qiáng);李寧求;付小哲;劉禮輝;石存斌;吳淑勤;;牡蠣養(yǎng)殖過程中副溶血弧菌流行情況調(diào)查[A];2010年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

7 朱振營;林祥梅;劉建;吳紹強(qiáng);仇松寅;王建武;薛振華;;轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因奶牛多重PCR快速檢測方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會食品衛(wèi)生學(xué)分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 傅玲琳;勵建榮;;浙江沿海地區(qū)海產(chǎn)品中副溶血弧菌表型及其主要毒力基因分布特征[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第七屆年會論文摘要集[C];2010年

9 朱章菱;劉敬忠;閆梅;;用多重PCR技術(shù)鑒定假兩性畸形[A];’96全國優(yōu)生科學(xué)大會大會學(xué)術(shù)講演與大會論文摘要匯編[C];1996年

10 何冬梅;朱海明;馬聰;柯碧霞;方偉;譚海玲;李柏生;鄧小玲;柯昌文;;廣東省食源性副溶血弧菌表型特征與分子分型比較研究[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 井 韋;把四天縮短為四小時[N];中國質(zhì)量報;2005年

2 張元躍;南寧海產(chǎn)品副溶血弧菌檢出率高達(dá)71.4%[N];中國食品質(zhì)量報;2006年

3 廣西獸醫(yī)研究所研究員 謝芝勛;多重聚合酶鏈反應(yīng)同時檢測鑒別疫病技術(shù)[N];中國畜牧報;2002年

4 高晶霞邋記者 吳天飛;市衛(wèi)生監(jiān)督部門發(fā)布食品安全預(yù)警[N];哈爾濱日報;2007年

5 本報記者 周麗;如何安全應(yīng)對腹瀉[N];河北日報;2006年

6 ;海鮮中毒進(jìn)入“高發(fā)期”[N];人民日報;2006年

7 韓振奎;腹瀉原因各不同胡亂止瀉惡果生[N];中國石化報;2004年

8 原河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)療系副主任、副教授 劉照福;腹瀉不可胡亂止[N];廣東科技報;2006年

9 符壯才 劉嫦玉;細(xì)菌鞭毛鍍銀染色有新方法[N];健康報;2006年

10 朱　�！　尉凑隆　『顦峰a;深圳局研發(fā)成功致病菌PCR檢測快速方法[N];中國國門時報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 祝儒剛;海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌PCR快速檢測體系建立及定量研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 蔣魯巖;副溶血弧菌分子生物學(xué)檢測方法的建立及其應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 陳萬義;副溶血弧菌高通量分子檢測方法的建立與基因分型研究[D];上海交通大學(xué);2011年

4 俞盈;副溶血弧菌VI型分泌系統(tǒng)功能及其調(diào)控[D];浙江大學(xué);2012年

5 王海榮;山東省畜禽魏氏梭菌分子流行病學(xué)研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

6 曹勝波;豬圓環(huán)病毒感染性分子克隆構(gòu)建及siRNA對rep基因表達(dá)抑制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 劉洪慶;山東省農(nóng)村已婚育齡婦女RTI干預(yù)與病原體篩查方法研究[D];山東大學(xué);2006年

8 鄧笑偉;嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥性與整合子關(guān)系的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2007年

9 金大智;重要病原菌檢測基因芯片的研制[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

10 許嘉;利用生物芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 于學(xué)東;鼠疫耶爾森氏菌多重PCR-微孔板雜交-EIA檢測技術(shù)的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

2 王慧;雞奇異變形桿菌致病性相關(guān)毒素檢測及PCR檢測方法的建立[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 范宏英;水體污染中常見食源性致病菌的PCR分子檢測研究[D];福建師范大學(xué);2005年

4 陸長勇;食源性致病菌多重PCR和基因芯片檢測方法的建立[D];上海交通大學(xué);2009年

5 佘花娣;基于SSR標(biāo)記的玉米品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

6 林密;羊支原體性肺炎多重PCR病原快速診斷技術(shù)與敏感性藥物篩選試驗研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

7 魯陽;應(yīng)用多重PCR方法對東北地區(qū)dystrophin基因缺失分布的研究及其應(yīng)用[D];中國醫(yī)科大學(xué);2003年

8 龐倩;副豬嗜血桿菌的分離鑒定及多重PCR檢測Hps和APP方法的建立[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 楊文杰;HBV DNA和HCV RNA的全血聯(lián)合快速檢測[D];鄭州大學(xué);2003年

10 王利國;牛新孢子蟲與牛瑟氏泰勒蟲多重PCR檢測方法的建立[D];延邊大學(xué);2007年

本文編號：2379382