【摘要】：銅綠假單胞菌是臨床常見的機會性致病菌,也是目前抗生素耐藥最嚴重的病原菌之一。近幾年來,人們提出了靶向細菌致病力的抗感染新思路。針對細菌的某些特定致病機制(如結(jié)合、侵入、毒素分泌、破壞宿主防護和信息系統(tǒng)等)靶向阻斷其致病過程,從而剝奪其致病力,達到抗感染的目的。與傳統(tǒng)的抗感染思路完全不同,它不影響細菌生長,因此不會產(chǎn)生細菌耐藥現(xiàn)象,也避免了抗生素所造成的體內(nèi)微生態(tài)紊亂,為有效地控制細菌感染帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。最近,在細菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一類普遍存在、長度在50～200個核苷酸、不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,稱為細菌非編碼小RNA(sRNA)。sRNA在細菌的物質(zhì)代謝、環(huán)境適應(yīng)、細菌致病力等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在真核生物中,RNAi技術(shù)作為一種基因沉默的有效工具得到了廣泛的應(yīng)用,并且已發(fā)展成為一種最有前途的疾病防治新方法。在前期研究中,我們分析了大腸桿菌內(nèi)源非編碼小RNA的結(jié)構(gòu)特征,首次建立了人工反式編碼小RNA(artificial trans-encoded sRNA, atsRNA)的設(shè)計原則,并在大腸桿菌中成功地對靶基因進行了有效的沉默。本文旨在利用人工設(shè)計反式編碼小RNA干擾銅綠假單胞菌的毒力因子表達并降低致病力,為抗感染和解決細菌耐藥難題提供嶄新的技術(shù)和方法。 首先,我們分析了已知銅綠假單胞菌內(nèi)源非編碼小RNA的共同結(jié)構(gòu)特征,提出了針對銅綠假單胞菌的atsRNA設(shè)計原則。以銅綠假單胞菌單基因控制的毒力因子彈性蛋白酶和外毒素A為靶點,分別設(shè)計了SRLB和SRTX系列atsRNAs;在銅綠假單胞菌中過量表達atsRNA,并檢測靶基因表達水平。實驗結(jié)果表明,彈性蛋白酶在SRLB2的干擾下,蛋白表達水平降低了57%, mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降34.9%；外毒素A在SRTX1作用下轉(zhuǎn)錄水平表達降低了30.6%。 其次,針對phzABCDEFG操縱子控制的毒力因子綠膿菌素,設(shè)計了SRphF系列和SRpzA系列atsRNAS。其中SRphF系列的靶基因phzF是phz操縱子中的第六個基因,編碼綠膿菌素合成的關(guān)鍵酶；SRpzA系列的靶基因phzA是phz操縱子第一個基因,與phz啟動子區(qū)域緊密相連。實驗結(jié)果顯示SRphF系列小RNA干擾效果不明顯,效果最好的SRphF2只使綠膿菌素合成量降低了15.8%；而SRphA系列干擾效果較好,SRpzA2干擾效率達到56%,SRpzA3能達到37%。以上說明,以操縱子控制的毒力因子為靶標設(shè)計atsRNA時,操縱子最前端基因的核糖體結(jié)合位點是有效干擾靶點。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了靶基因-熒光蛋白融合載體pACYC-T7-phzF-EGFP,并在大腸桿菌BL21中共表達了SRphF系列atsRNAs和pACYC-T7-phzF-EGFP。熒光檢測結(jié)果顯示,在銅綠假單胞菌中干擾效率極低的SRphF系列人工反式編碼小RNA在大腸桿菌BL21內(nèi)干擾效果顯著,SRphF2、3、5干擾后熒光表達量均有下降。其中SRphF2干擾后,pACYC-T7-phzF-EGFP熒光表達量下降了83.5%,遠遠高于其在銅綠假單胞菌種的干擾效率15.4%。這一實驗結(jié)果表明,兩種細菌中atsRNAs的干擾作用存在一定差異。 最后,針對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)rhl和las系統(tǒng)的調(diào)控蛋白RhlR和LasR設(shè)計了SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs。RT-PCR檢測結(jié)果表明,SRrhlR4使PAO1菌株rhlR在mRNA水平上降低了79%,并使受rhl系統(tǒng)控制的下游彈性蛋白酶活力降低了36.4%；SRlaR3降低了lasR mRNA的63%,彈性蛋白酶活力降低了32.7%。近年來的研究表明,干擾細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)可以作為潛在的防治細菌病害的新途徑,我們通過SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs成功干擾了rhlR, lasR基因的表達,并一定程度上降低了毒力因子彈性蛋白酶的合成。 綜上所述,我們初步建立了一種在銅綠假單胞菌中利用atsRNA干擾毒力因子表達的方法。通過對單基因控制的毒力靶點、操縱子控制的綠膿菌素以及群體感應(yīng)調(diào)控基因的有效干擾,從一定程度上降低了銅綠假單胞菌的致病力,為銅綠假單胞菌引起的相關(guān)感染的防治提供了新途徑,并為解決細菌耐藥難題創(chuàng)造了條件。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R378

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬鵬鵬,薛社普,韓代書;RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2003年02期

，

本文編號：2376904