【摘要】： 背景:內(nèi)皮祖細胞(EPCs)屬于造血干細胞的一個亞群,它們直接參與體內(nèi)血管新生和修復。Asahara等人于1997年成功地從人類外周血中分離出表達CD34,Flk-1,或AC133抗原陽性的細胞,并被證實為EPCs。循環(huán)血中EPCs歸巢到機體的相應部位并分化為內(nèi)皮細胞,參與構(gòu)成新生血管,這個過程稱之為出生后血管發(fā)生。血管發(fā)生以往被認為只存在于胚胎期的血管新生過程中,但近來的許多研究證明:出生后同樣可以存在血管發(fā)生。最近的動物實驗研究證實:外源性EPCs移植對下肢和心臟缺血性病變產(chǎn)生一定的治療效果,這為臨床缺血性血管疾病的治療提供了新思路。 研究目的:通過研究,探索改進人外周血中EPCs分離和體外培養(yǎng)的方法,探明人外周血中EPCs體外培養(yǎng)的生長特征,找尋最佳細胞干預時期,為人外周血EPCs的研究奠定基礎(chǔ)。同時,利用Transwell培養(yǎng)皿模擬體外EPCs的遷移過程,觀察阿司匹林對EPCs的體外遷移功能的影響,旨在為臨床缺血性血管疾病治療中阿司匹林的合理應用提供參考。 方法:本研究方法圍繞著EPCs分為相互關(guān)聯(lián)的兩部分 一、人類外周血內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定:無菌條件下采集健康捐獻者外周靜脈血20ml,運用Ficoll密度梯度離心法,將常規(guī)的2000rpm調(diào)整至1200rpm,分離外周血中單個核細胞(MNCs),經(jīng)過細胞計數(shù),臺盼藍染色鑒定細胞活力后,用含有10%優(yōu)級胎牛血清的人類內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基按常規(guī)進行培養(yǎng)。對培養(yǎng)所得的細胞每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)學變化,觀測評價細胞生長過程。并進行EPCs特征和功能的鑒定:1、VEGFR-2、CD133、vWF的免疫熒光檢測;2、細胞攝取acLDL和結(jié)合UEA-1實驗。 二、阿司匹林對內(nèi)皮祖細胞遷移功能的影響:在第一部分研究的基礎(chǔ)上,選擇培養(yǎng)7天的細胞進行這一步研究。將培養(yǎng)7天的細胞消化,重懸,計數(shù)后將懸液放入Transwell培養(yǎng)皿的上室。將含有不同濃度阿司匹林的含血清培養(yǎng)液加入到Transwell培養(yǎng)皿的下室,將Transwell培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后計數(shù)遷移到低層的細胞,以觀察評價細胞遷移能力。通過與無阿司匹林的含血清培養(yǎng)液組比較,觀測不同濃度作用相同時間或同一濃度作用不同時間,阿司匹林對人外周血中EPCs遷移功能的影響。 結(jié)果:將離心速度調(diào)整至1200rpm后,每ml外周血經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離可得到MNCs 1×10~6～2×10~6個,臺盼藍染色后活細胞百分率在95±3%。培養(yǎng)后早期細胞大多為圓形或橢圓形,混有少量紡錘形細胞,第5天起,部分圓形大單核細胞轉(zhuǎn)化為梭形貼壁內(nèi)皮祖細胞;7天左右出現(xiàn)由數(shù)十個細胞形成的細胞集落,并可見到細胞呈條索狀排列;10天左右,細胞變?yōu)殚L梭形,相互交聯(lián);14天后細胞開始衰老、崩解,數(shù)量減少。在培養(yǎng)的第7天,細胞生長性狀最佳,通過檢測,細胞的內(nèi)皮祖細胞系特異性標志因子VEGFR-2、CD133與vWF表達良好,攝取acLDL和結(jié)合UEA-1實驗均呈強陽性。選取培養(yǎng)第7天的細胞,采用Transwell培養(yǎng)皿檢測阿司匹林對EPCs遷移能力的影響,在200倍顯微鏡下計數(shù)Transwell膜底面的遷移細胞。無阿司匹林對照組26.8±1.73,加入1mmol/L阿司匹林組24.3±1.94,加入2mmol/L阿司匹林組20.1±2.57,加入5mmol/L阿司匹林組13.1±1.87,加入10mmol/L阿司匹林組9.2±1.58。經(jīng)統(tǒng)計分析證實,加入阿司匹林組Transwell膜底面細胞數(shù)較對照組顯著減少,隨著加入阿司匹林的濃度增加,Transwell膜底面細胞數(shù)的減少幅度更為明顯。 結(jié)論: 1、在25～37℃條件下,采用離心速度為1200rpm的密度梯度離心法可以良好的分離人外周血單個核細胞,以滿足EPCs培養(yǎng)的需要。 2、內(nèi)皮祖細胞的表型鑒定和活性測定顯示其旺盛生長期在培養(yǎng)后的第7—10天,在此期間,其增殖活躍,生長情況較好,是進一步進行研究的最佳時期。 3、在Transwell培養(yǎng)過程中,1mmol/L的阿司匹林就能對EPCs的體外遷移產(chǎn)生抑制作用,這種抑制作用具有明顯的濃度和時間依賴性。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【引證文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李曉召;阿托伐他汀對人外周血培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及功能的影響[D];鄭州大學;2010年

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本文編號：2376119