【摘要】： 雙酚A(bisPhenol A, BPA)是一種具有代表性的內(nèi)分泌干擾物,具有弱雌激素活性,廣泛用于食品和飲料的包裝材料碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂、牙齒填充劑及相關(guān)產(chǎn)品的制造。目前,BPA對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)BPA不僅可影響腦形態(tài)結(jié)構(gòu)的發(fā)育,還可影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)以及神經(jīng)行為的發(fā)育。樹突發(fā)育是腦發(fā)育的重要過程,其結(jié)構(gòu)和特性決定突觸信息的傳遞功效。發(fā)育早期樹突分支的生長和結(jié)構(gòu)變化迅速,參與突觸發(fā)生、樹突分支形成,以及樹突棘的發(fā)育。樹突分支過度生長可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能異常。內(nèi)源性雌激素影響樹突發(fā)育和突觸發(fā)生,因此推測具有雌激素活性的BPA也可能會影響樹突的發(fā)育。谷氨酸NMDA受體在腦內(nèi)廣泛分布,并且與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。有研究表明,NMDA受體參與神經(jīng)回路的形成和學(xué)習(xí)記憶過程,可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活,軸突和樹突的結(jié)構(gòu)發(fā)育以及突觸的可塑性等,為所有興奮性突觸的突觸后必需組份。而雌激素影響樹突發(fā)育與NMDA受體有關(guān)。鑒于NMDA受體在樹突發(fā)育中的重要作用,本研究通過BPA染毒體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,觀察BPA急性和長時暴露對樹突形態(tài)發(fā)育、NMDA受體亞基表達(dá)和磷酸化、以及雌激素受體β(Estrogen RecePtor beta, ERβ)表達(dá)的影響,以確定發(fā)育期BPA暴露是否改變樹突形態(tài)發(fā)生,并影響神經(jīng)元NMDA受體和雌激素受體的表達(dá),探討B(tài)PA影響神經(jīng)元樹突形態(tài)發(fā)育是否與NMDA受體相關(guān),雌激素受體是否參與了這一過程,為探索BPA影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育奠定基礎(chǔ)。 方法：采用腺病毒感染體外培養(yǎng)第5天(5 DIV)的海馬神經(jīng)元,使其表達(dá)綠熒光,通過活細(xì)胞成像觀測BPA染毒對海馬神經(jīng)元樹突形態(tài)動力學(xué)變化。實驗分5個組：對照組(DMSO), BPA各劑量組(濃度分別為1、10、100、1000 nM)。BPA急性暴露時間為0.5 h,慢性暴露時間為24 h。染毒后,在熒光顯微鏡下對神經(jīng)元(7DIV)進(jìn)行活細(xì)胞成像,每2 min拍攝一張圖片,共11張1組,動態(tài)顯現(xiàn)神經(jīng)元樹突的生長。采用Image-Pro Plus分析圖像,測定樹突絲的運動性(μm/20 min)、樹突絲密度以及樹突分支總長度。用10μM雌激素受體阻斷劑ICI 182,780預(yù)處理海馬培養(yǎng)物0.5 h,然后再進(jìn)行BPA染毒,以分析BPA對樹突形態(tài)發(fā)育的影響時否通過雌激素受體進(jìn)行。通過BPA和10nME2的共同暴露,分析BPA與雌激素對樹突發(fā)育的共同作用。 為了進(jìn)一步分析BPA影響樹突發(fā)育的機(jī)制,采用細(xì)胞免疫染色法,用兔來源多克隆NR1、NR2B、P-NR2B(PhosPhorylated NR2B)和ERβ抗體檢測了NMDA受體NR1、NR2B、磷酸化NR2B亞基以及ERβ蛋白的表達(dá),并經(jīng)Image-Pro Plus分析圖像,測定各組細(xì)胞的光密度值。 結(jié)果：1.BPA(10～1000 nM)急性暴露0.5 h快速增加樹突絲的運動性和密度(P0.05,P0.01或P0.001),該作用可以被雌激素受體阻斷劑抑制(P0.001)；但如果BPA與E2(10 nM)共同給藥,BPA或E2單獨給藥誘導(dǎo)的樹突運動性和密度的增加被抑制。BPA(10、100 nM)長時暴露24 h顯著增加樹突絲的運動性和密度以及樹突分支總長度(P0.001),該作用也可被雌激素受體阻斷劑抑制(P＜0.05); BPA與E2 (10nM)共同給藥,BPA或E2單獨給藥表現(xiàn)的增強(qiáng)作用被抑制(P0.05)。 2. BPA (10～1000 nM)急性暴露0.5 h,沒有改變NR1、NR2B的表達(dá),但卻劑量依賴性地上調(diào)了磷酸化NMDA受體2B亞基(P-NR2B)的表達(dá)(P0.05或P＜0.001),這種上調(diào)作用可被雌激素受體阻斷劑抑制(P＜0.01)。E2 (10nM)增加磷酸化NR2B的表達(dá),如果BPA與E2共同給藥,BPA或E2單獨給藥誘導(dǎo)的磷酸化NR2B表達(dá)上調(diào)被抑制(P0.001)。BPA(100、1000 nM)暴露24 h顯著下調(diào)NR1、NR2B亞基的表達(dá)(P0.001),該作用不受雌激素受體阻斷劑的影響；E2 (10 nM)上調(diào)NR1、NR2B亞基的表達(dá),如果BPA與E2共同給藥, E2單獨作用誘導(dǎo)NR1、NR2亞基表達(dá)的增加受到抑制。 3. BPA (10～1000 nM)急性暴露0.5 h沒有引起ERβ蛋白表達(dá)的改變,而長時暴露24 h可以上調(diào)ERβ蛋白的表達(dá)(P0.001),雌激素受體阻斷劑可以抑制該作用(P0.01)；BPA與E2共同給藥與BPA或E2單獨給藥對ERp表達(dá)的影響無明顯差異,均可誘導(dǎo)ERβ表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：BPA急性暴露可以快速增加體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元樹突絲的運動性和密度,促進(jìn)NMDA受體2B亞基的磷酸化,但不改變海馬神經(jīng)元NR1,NR2B亞基和ERβ蛋白的表達(dá)。雌激素受體可能參與了BPA這些作用,由于核內(nèi)雌激素受體介導(dǎo)的效應(yīng)產(chǎn)生作用較慢,推測BPA快速作用可能通過膜雌激素受體進(jìn)行。 BPA慢性暴露增加樹突絲運動性和密度,以及樹突分支總長度,促進(jìn)ERβ蛋白表達(dá),卻下調(diào)NR1,NR2B亞基的表達(dá)。雌激素受體可能參與了BPA增加樹突絲運動性和密度、樹突分支總長度,以及上調(diào)ER表蛋白表達(dá)的作用,而BPA對NR1、NR2B表達(dá)的影響可能通過其它途徑進(jìn)行。 與E2相似,無論急性或慢性暴露,BPA都可增加樹突絲運動性和密度以及磷酸化NR2B的表達(dá)；而BPA與E2共同暴露時,BPA或E2單獨給藥對樹突絲運動性和密度以及磷酸化NR2B表達(dá)的增加作用被抑制,二者表現(xiàn)出相互拮抗作用。 綜上所述,BPA快速作用影響樹突形態(tài)發(fā)育及NMDA受體的磷酸化活性,該作用可能通過膜相關(guān)雌激素受體的介導(dǎo)。慢性暴露不僅可影響樹突形態(tài)的發(fā)育,也可改變NMDA受體蛋白的表達(dá),從而對腦發(fā)育產(chǎn)生重要影響。
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【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【引證文獻(xiàn)】

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1 張夏微;張丹參;;雌激素和Glu-NMDA受體通路與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];神經(jīng)藥理學(xué)報;2011年06期

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1 王曉梅;雙酚A對小鼠肝、腎氧化損傷的影響[D];南華大學(xué);2013年

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本文編號：2370696