【摘要】： 關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見疾患,由于其無神經(jīng)支配、缺乏血液供應(yīng)、軟骨細胞增殖遷移能力低等組織學(xué)特點,關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力非常有限,損害后易出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)功能障礙,因此關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療是運動醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點之一。目前實驗和臨床研究證實應(yīng)用軟骨下骨板鉆孔或微骨折等技術(shù),可使骨髓腔內(nèi)未分化的間充質(zhì)細胞(BMSCs)遷移到缺損區(qū),并增殖、分化形成類透明軟骨組織,盡管遠期效果不理想,但也顯示了關(guān)節(jié)軟骨組織在特定的條件下具有一定的修復(fù)能力。因此提高骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞定向分化能力并進一步改善新生軟骨的質(zhì)量,可能是促進關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的有效途徑之一。而近年來的研究表明低強度脈沖超聲(LowIntensity Pulsed Ultrasound)能促進骨折、骨不連的愈合,其機制是加速了軟骨的形成及軟骨內(nèi)骨化。也有動物實驗研究報道,低強度脈沖超聲波具有促進關(guān)節(jié)骨-軟骨缺損修復(fù)的作用。然而目前關(guān)于LIPU對BMSCs等生物學(xué)效應(yīng)及作用機制仍缺乏了解,臨床應(yīng)用缺乏足夠的理論和實驗依據(jù)。本課題擬通過構(gòu)建BMSCs-軟骨細胞的藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系,予以不同強度LIPU刺激,觀察BMSCs的增殖能力、細胞表型及合成分泌細胞外特異性基質(zhì)、細胞調(diào)控因子水平的變化,從細胞、分子生物等層面探討LIPU對BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)及可能的作用機制。 目的: 構(gòu)建BMSCs、軟骨細胞的藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系,探討軟骨細胞的體外三維培養(yǎng)微環(huán)境對BMSCs增殖、成軟骨分化的影響;對體外BMSCs-軟骨細胞三維共培養(yǎng)體系施加LIPU刺激,觀察細胞生物學(xué)改變情況,探討LIPU對BMSCs的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制,為LIPU在臨床中的進一步合理應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。 方法: 1.采用機械粉碎結(jié)合酶消化法獲取兔關(guān)節(jié)軟骨細胞,通過體外平面培養(yǎng)擴增、傳代,應(yīng)用細胞形態(tài)學(xué)、Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細胞表型。 2.采用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法從兔骨髓組織中分離、純化BMSCs,進行體外平面培養(yǎng)擴增,應(yīng)用免疫組化染色、流式細胞儀分析細胞表面標(biāo)志物等方法對細胞表型、純度進行鑒定。 3.采用藻酸鹽凝膠復(fù)合軟骨細胞、BMSCs構(gòu)建三維共培養(yǎng)體系,通過細胞計數(shù)、繪制生長曲線、H-E染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色等觀察藻酸鹽三維凝膠中細胞生物學(xué)性狀的變化。 4.對BMSCs、軟骨細胞的藻酸鹽凝膠三維共培養(yǎng)體系予以強度為2mW/cm~2、10mW/cm~2、30mW/cm~2的LIPU刺激,觀察細胞形態(tài)、細胞增殖及表型的變化;應(yīng)用Ⅱ型膠原免疫組化染色法、甲苯胺藍染色法檢測細胞基質(zhì)中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅹ型膠原及蛋白多糖蛋白合成分泌情況;應(yīng)用RT-PCR法檢測細胞aggrecan與Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅹ型膠原mRNA的表達情況;應(yīng)用RT-PCR、Western-bloting法檢測細胞分化調(diào)控因子TGF-β1、IGF-Ⅰ、bFGF的表達情況。 結(jié)果: 1.原代及第1-3代軟骨細胞貼壁后呈多角形,細胞形態(tài)、大小相近,融合區(qū)細胞呈典型的鋪路石狀,Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性,顯示其具有分泌軟骨細胞特征性基質(zhì)Ⅱ型膠原的能力。 2.培養(yǎng)的BMSCs貼壁能力很強,細胞形態(tài)為短梭形或紡錘形,細胞形態(tài)、大小相近;采用免疫細胞化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的第1-3代細胞表達細胞表面抗原CD29、CD44、CD105,不表達CD14、CD34、CD45;同時,Ⅱ型、Ⅹ型膠原免疫組化染色陰性,顯示所培養(yǎng)的細胞為未分化的BMSCs。 3.藻酸鹽凝膠具有一定的彈性和強度及良好的組織相容性,軟骨細胞、BMSCs在藻酸鹽凝膠中具有良好的生物學(xué)活性;免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)與軟骨細胞共培養(yǎng)的BMSCs的Ⅱ型膠原染色陽性,而對照組為陰性,說明體外軟骨細胞三維培養(yǎng)微環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs定向分化成軟骨細胞。。 4.LIPU不影響B(tài)MSCs的活性;可促進BMSCs增殖并合成軟骨組織特異性細胞外基質(zhì),其效應(yīng)與超聲波的強度相關(guān)。強度為2mW/cm~2、10mW/cm~2的LIPU促進BMSCs向軟骨細胞轉(zhuǎn)化,增加Ⅱ型膠原、蛋白多糖合成分泌,上調(diào)TGF-β1、IGF-ⅠmRNA表達。強度為30mW/cm2的LIPU促進BMSCs向肥大軟骨細胞轉(zhuǎn)化,增加Ⅱ型、Ⅹ型膠原、蛋白多糖合成分泌增加,上調(diào)TGF-β1、IGF-Ⅰ、bFGF mRNA表達。 結(jié)論: 1.通過機械粉碎酶消化法可獲取關(guān)節(jié)軟骨細胞,經(jīng)單層傳代培養(yǎng)擴增可在短時間內(nèi)獲得足量、純化的、具有良好生物學(xué)活性兔關(guān)節(jié)軟骨細胞。 2.通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法可分離、純化骨髓間充質(zhì)干細胞,經(jīng)過體外單層培養(yǎng)擴增可獲得成分單一、未分化的BMSCs。該方法簡便有效,分離、純化效果較理想,收獲的第1至第3代BMSCs可作為后續(xù)實驗研究的種子細胞。 3.軟骨細胞-藻酸鹽凝膠與BMSCs-藻酸鹽凝膠在體外共培養(yǎng)可成功誘導(dǎo)BMSCs分化成軟骨細胞,提示除了傳統(tǒng)添加生長因子的誘導(dǎo)方法以外,與同類細胞共培養(yǎng)的方法可能是更經(jīng)濟而有效的干細胞誘導(dǎo)分化方法。 4.LIPU具有促進BMSCs增殖的作用,強度為30mW/cm~2LIPU的效應(yīng)最為明顯。LIPU刺激可促進BMSCs向軟骨細胞分化。2mW/cm~2組、10mW/cm~2組可促進BMSCs增殖,誘導(dǎo)其分化成軟骨細胞,以Ⅱ型膠原明顯增加為特征;30mW/cm~2組可明顯促進BMSCs增殖,誘導(dǎo)其分化成肥大軟骨細胞,以Ⅹ型膠原明顯增加為特征,長時間刺激可進一步誘導(dǎo)分化為成骨細胞。 5.LIPU作用于細胞后產(chǎn)生獨特的空泡效應(yīng)、機械效應(yīng)和溫?zé)嵝?yīng),通過影響細胞骨架結(jié)構(gòu)、細胞膜的通透性或通過第二信使系統(tǒng)來發(fā)揮作用,改變細胞調(diào)控因子TGF-β1、IGF-Ⅰ、bFGF等基因表達,再通過細胞自分泌、旁分泌途徑誘導(dǎo)BMSCs定向分化成軟骨細胞。2mW/cm~2組、10mW/cm~2 LIPU通過上調(diào)TGF-β1、IGF-Ⅰ的表達,促進BMSCs定向分化成軟骨細胞;30mW/cm~2 LIPU通過同時上調(diào)TGF-β1、IGF-Ⅰ、bFGF的表達,促進BMSCs分化成肥大軟骨細胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R312

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本文編號：2367697