【摘要】： 造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)已被用于基因治療、腫瘤凈化和造血重建等方面，然而由于HSCs資源匱乏，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。雖然前人對(duì)HSCs的體外擴(kuò)增已經(jīng)做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，但由于培養(yǎng)條件對(duì)HSCs體外擴(kuò)增的影響非常復(fù)雜，在不同的培養(yǎng)條件下，擴(kuò)增效果差別很大，至今尚未有HSCs體外擴(kuò)增條件優(yōu)化方面的報(bào)道。因此，如果能夠找到一種適宜的數(shù)學(xué)方法來(lái)建立HSCs體外培養(yǎng)條件與擴(kuò)增效果之間的定量關(guān)系，對(duì)于優(yōu)化HSCs體外培養(yǎng)條件以及解決臨床應(yīng)用上所面臨的HSCs數(shù)量不足的難題無(wú)疑具有重大意義。 本文首先采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對(duì)HSCs的體外擴(kuò)增能力建立了評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)模型。從文獻(xiàn)上總結(jié)前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共獲得341組數(shù)據(jù)。選取細(xì)胞接種密度、細(xì)胞因子組合、細(xì)胞來(lái)源、血清、基質(zhì)細(xì)胞、反應(yīng)器類(lèi)型和培養(yǎng)時(shí)間等7個(gè)影響因子作為網(wǎng)絡(luò)輸入特征參數(shù)，分別對(duì)有核細(xì)胞(Nuclear cells，NCs)、CD34~+細(xì)胞和成集落細(xì)胞(Colony-formingunits，CFU-Cs)進(jìn)行體外擴(kuò)增能力的評(píng)價(jià)及預(yù)測(cè)。選取124、90及86組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別用于NCs、CFU-Cs和CD34~+細(xì)胞為評(píng)價(jià)指標(biāo)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練；而17、10及14組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別用于NCs、CFU-Cs和CD34~+細(xì)胞為評(píng)價(jià)指標(biāo)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)NCs、CFU-Cs和CD34~+細(xì)胞的區(qū)間訓(xùn)練準(zhǔn)確率分別為85．5％、86．1％和86．7％；區(qū)間預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別為82．4％、71．4％和70．0％。由此可知，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的非線(xiàn)性模擬使定量描述HSCs體外擴(kuò)增效果與培養(yǎng)條件間的關(guān)系及預(yù)測(cè)HSCs的最佳體外擴(kuò)增條件成為可能。 除了對(duì)文獻(xiàn)上已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)與預(yù)測(cè)外，本文還應(yīng)用所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道之外的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)其擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了預(yù)測(cè)。將影響HSCs體外擴(kuò)增的7個(gè)主要影響因素的取值進(jìn)行定義并對(duì)各取值進(jìn)行組合，共得到18480組培養(yǎng)條件。這其中只有少部分培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，但絕大部分培養(yǎng)條件的預(yù)測(cè)結(jié)果尚未驗(yàn)證。為了安全可靠地使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所預(yù)測(cè)的優(yōu)化培養(yǎng)條件，必須對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的外推預(yù)測(cè)能力進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 因此，本研究從18480組培養(yǎng)條件中共篩選出6組具有代表性的培養(yǎng)條件進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由于其中多組實(shí)驗(yàn)都需要采用海藻酸鈣-殼聚糖(Alginate chitosan，AC)膠珠包埋基質(zhì)細(xì)胞再與HSCs共培養(yǎng)，為此，首先通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選，確定了AC膠珠的最佳制備工藝為：海藻酸鈉的濃度為1％(w／v)、氯化鈣的濃度為3％(w／v)、殼聚糖的濃度為1％(w／v)、第一步和第二步反應(yīng)時(shí)間均為8分鐘。在確定了AC膠珠最佳制備工藝的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)的方法確定了AC膠珠包埋兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)支持臍帶血(Umbilical cord blood，UCB)HSCs擴(kuò)增的最佳條件為：兔骨髓MSCs在海藻酸鈉內(nèi)的接種密度為2×10~5cells·mL~(-1)，高低粘度殼聚糖的混合質(zhì)量比為3：1及單核細(xì)胞(Mononuclear cells，MNCs)與兔骨髓MSCs的接種比例為5：1。該結(jié)果為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及后續(xù)的反應(yīng)器內(nèi)共培養(yǎng)UCB-HSCs和UCB-MSCs兩種干細(xì)胞確定了AC膠珠包埋基質(zhì)細(xì)胞的最佳條件。 6組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于CD34~+細(xì)胞、NCs及CFU-Cs和的體外擴(kuò)增，分別有4、5及6組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合，準(zhǔn)確率分別為67．7％、83．3％及100％。該結(jié)果充分證明了本論文所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型在HSCs體外擴(kuò)增的模擬分析與預(yù)測(cè)上的可靠性與適用性。 臍帶血中所含的另一種干細(xì)胞UCB-MSCs，不僅可以作為滋養(yǎng)層細(xì)胞支持HSCs在體外的大規(guī)模擴(kuò)增，在造血移植過(guò)程中還能夠降低并發(fā)癥的發(fā)生率以及加速造血重建功能的恢復(fù)。但是目前UCB-MSCs的原代優(yōu)化培養(yǎng)成功率(Probability)一般只有50％～60％，為了進(jìn)一步提高培養(yǎng)成功率，本文利用正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)UCB-MSCs體外培養(yǎng)的主要影響因素：細(xì)胞的接種密度、細(xì)胞因子的組合及用量、是否添加血清和滋養(yǎng)層細(xì)胞，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)篩選：并對(duì)培養(yǎng)出的UCB-MSCs進(jìn)行了細(xì)胞免疫表型分析和多向誘導(dǎo)分化檢測(cè)，以期獲得UCB-MSCs培養(yǎng)的最佳方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSCs在以高細(xì)胞密度接種的基礎(chǔ)上添加15ng·mL~(-1)IL-3和5ng·mL~(-1)GM-CSF，可大大提高UCB-MSCs的原代培養(yǎng)成功率，從50％～60％提高到90％以上。細(xì)胞免疫表型分析結(jié)果顯示，所分離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)表面標(biāo)志CD13、CD29、CD44及CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞的相關(guān)表面標(biāo)志CD34、CD45及HLA-DR；并能夠向骨、軟骨及脂肪細(xì)胞分化，這與骨髓來(lái)源的MSCs相一致。利用本文所建立的培養(yǎng)方法，能夠?yàn)閁CB-MSCs的臨床應(yīng)用提供大量?jī)?yōu)質(zhì)的種子細(xì)胞。 最后，對(duì)臍帶血中所含有的HSCs和MSCs兩種干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)研究，無(wú)疑具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本文在不添加血清、只添加細(xì)胞因子組合(SCF 15 ng·mL~(-1)，F(xiàn)L 5ng·mL~(-1)，TPO 6 ng·mL~(-1)，IL-3 15 ng·mL~(-1)，G-CSF 1 ng·mL~(-1)，GM-CSF 5 ng·mL~(-1))及AC膠珠包被基質(zhì)細(xì)胞支持的條件下，采用微載體與生物反應(yīng)器相結(jié)合的策略，考察了UCB-HSCs與UCB-MSCs在轉(zhuǎn)瓶及旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器(Rotating wall vessel bioreactor，RWVB)內(nèi)的共培養(yǎng)。結(jié)果表明，在RWVB中的擴(kuò)增效果最佳，12天內(nèi)NCs擴(kuò)增了3．7±0．3倍；CFU-Cs擴(kuò)增了5．1±1．2倍；CD34~+CD45~+CD105~-(HSCs)細(xì)胞擴(kuò)增了5．2±0．4倍；CD34~-CD45~-CD105~+(MSCs)細(xì)胞擴(kuò)增了13．9±1．2倍。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)自由沉降的方法分離UCB-HSCs和粘附在玻璃包被的苯乙烯聚合物(Glass coated styrenecopolymer，GCSC)微載體表面的UCB-MSCs。同時(shí)，細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化及免疫表型分析結(jié)果顯示，粘附在GCSC微載體表面上的細(xì)胞能夠向骨、軟骨及脂肪細(xì)胞分化；并能夠表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志CD13，CD44，CD73和CD105，，而不表達(dá)造血細(xì)胞的相關(guān)表面標(biāo)志CD34，CD45及HLA-DR，與骨髓MSCs相一致。該結(jié)果說(shuō)明，采用RWVB并在添加細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞及微載體支持的條件下，能夠?qū)崿F(xiàn)UCB-HSCs和UCB-MSCs的聯(lián)合共培養(yǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2366768