【摘要】： 造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)已被用于基因治療、腫瘤凈化和造血重建等方面，然而由于HSCs資源匱乏，嚴重限制了其臨床應用。雖然前人對HSCs的體外擴增已經(jīng)做了大量的實驗研究，但由于培養(yǎng)條件對HSCs體外擴增的影響非常復雜，在不同的培養(yǎng)條件下，擴增效果差別很大，至今尚未有HSCs體外擴增條件優(yōu)化方面的報道。因此，如果能夠找到一種適宜的數(shù)學方法來建立HSCs體外培養(yǎng)條件與擴增效果之間的定量關系，對于優(yōu)化HSCs體外培養(yǎng)條件以及解決臨床應用上所面臨的HSCs數(shù)量不足的難題無疑具有重大意義。 本文首先采用神經(jīng)網(wǎng)絡技術對HSCs的體外擴增能力建立了評價及預測模型。從文獻上總結前人的實驗結果，共獲得341組數(shù)據(jù)。選取細胞接種密度、細胞因子組合、細胞來源、血清、基質細胞、反應器類型和培養(yǎng)時間等7個影響因子作為網(wǎng)絡輸入特征參數(shù)，分別對有核細胞(Nuclear cells，NCs)、CD34~+細胞和成集落細胞(Colony-formingunits，CFU-Cs)進行體外擴增能力的評價及預測。選取124、90及86組實驗數(shù)據(jù)分別用于NCs、CFU-Cs和CD34~+細胞為評價指標的神經(jīng)網(wǎng)絡訓練；而17、10及14組實驗數(shù)據(jù)分別用于NCs、CFU-Cs和CD34~+細胞為評價指標的神經(jīng)網(wǎng)絡預測。結果表明，對NCs、CFU-Cs和CD34~+細胞的區(qū)間訓練準確率分別為85．5％、86．1％和86．7％；區(qū)間預測準確率分別為82．4％、71．4％和70．0％。由此可知，人工神經(jīng)網(wǎng)絡的非線性模擬使定量描述HSCs體外擴增效果與培養(yǎng)條件間的關系及預測HSCs的最佳體外擴增條件成為可能。 除了對文獻上已有的實驗數(shù)據(jù)進行評價與預測外，本文還應用所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡模型對文獻報道之外的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化并對其擴增結果進行了預測。將影響HSCs體外擴增的7個主要影響因素的取值進行定義并對各取值進行組合，共得到18480組培養(yǎng)條件。這其中只有少部分培養(yǎng)條件的實驗結果得到實驗數(shù)據(jù)的驗證，但絕大部分培養(yǎng)條件的預測結果尚未驗證。為了安全可靠地使用神經(jīng)網(wǎng)絡模型所預測的優(yōu)化培養(yǎng)條件，必須對神經(jīng)網(wǎng)絡的外推預測能力進行實驗驗證。 因此，本研究從18480組培養(yǎng)條件中共篩選出6組具有代表性的培養(yǎng)條件進行了驗證實驗。由于其中多組實驗都需要采用海藻酸鈣-殼聚糖(Alginate chitosan，AC)膠珠包埋基質細胞再與HSCs共培養(yǎng)，為此，首先通過正交實驗篩選，確定了AC膠珠的最佳制備工藝為：海藻酸鈉的濃度為1％(w／v)、氯化鈣的濃度為3％(w／v)、殼聚糖的濃度為1％(w／v)、第一步和第二步反應時間均為8分鐘。在確定了AC膠珠最佳制備工藝的基礎上，進一步通過正交實驗的方法確定了AC膠珠包埋兔骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)支持臍帶血(Umbilical cord blood，UCB)HSCs擴增的最佳條件為：兔骨髓MSCs在海藻酸鈉內的接種密度為2×10~5cells·mL~(-1)，高低粘度殼聚糖的混合質量比為3：1及單核細胞(Mononuclear cells，MNCs)與兔骨髓MSCs的接種比例為5：1。該結果為驗證實驗及后續(xù)的反應器內共培養(yǎng)UCB-HSCs和UCB-MSCs兩種干細胞確定了AC膠珠包埋基質細胞的最佳條件。 6組驗證實驗結果顯示，對于CD34~+細胞、NCs及CFU-Cs和的體外擴增，分別有4、5及6組驗證實驗結果與預測結果相吻合，準確率分別為67．7％、83．3％及100％。該結果充分證明了本論文所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡模型在HSCs體外擴增的模擬分析與預測上的可靠性與適用性。 臍帶血中所含的另一種干細胞UCB-MSCs，不僅可以作為滋養(yǎng)層細胞支持HSCs在體外的大規(guī)模擴增，在造血移植過程中還能夠降低并發(fā)癥的發(fā)生率以及加速造血重建功能的恢復。但是目前UCB-MSCs的原代優(yōu)化培養(yǎng)成功率(Probability)一般只有50％～60％，為了進一步提高培養(yǎng)成功率，本文利用正交實驗方法對UCB-MSCs體外培養(yǎng)的主要影響因素：細胞的接種密度、細胞因子的組合及用量、是否添加血清和滋養(yǎng)層細胞，進行正交實驗篩選：并對培養(yǎng)出的UCB-MSCs進行了細胞免疫表型分析和多向誘導分化檢測，以期獲得UCB-MSCs培養(yǎng)的最佳方法。實驗結果表明，MSCs在以高細胞密度接種的基礎上添加15ng·mL~(-1)IL-3和5ng·mL~(-1)GM-CSF，可大大提高UCB-MSCs的原代培養(yǎng)成功率，從50％～60％提高到90％以上。細胞免疫表型分析結果顯示，所分離培養(yǎng)的細胞表達間質細胞的相關表面標志CD13、CD29、CD44及CD105，不表達造血細胞的相關表面標志CD34、CD45及HLA-DR；并能夠向骨、軟骨及脂肪細胞分化，這與骨髓來源的MSCs相一致。利用本文所建立的培養(yǎng)方法，能夠為UCB-MSCs的臨床應用提供大量優(yōu)質的種子細胞。 最后，對臍帶血中所含有的HSCs和MSCs兩種干細胞進行共培養(yǎng)研究，無疑具有重要的臨床應用價值。本文在不添加血清、只添加細胞因子組合(SCF 15 ng·mL~(-1)，F(xiàn)L 5ng·mL~(-1)，TPO 6 ng·mL~(-1)，IL-3 15 ng·mL~(-1)，G-CSF 1 ng·mL~(-1)，GM-CSF 5 ng·mL~(-1))及AC膠珠包被基質細胞支持的條件下，采用微載體與生物反應器相結合的策略，考察了UCB-HSCs與UCB-MSCs在轉瓶及旋轉壁式生物反應器(Rotating wall vessel bioreactor，RWVB)內的共培養(yǎng)。結果表明，在RWVB中的擴增效果最佳，12天內NCs擴增了3．7±0．3倍；CFU-Cs擴增了5．1±1．2倍；CD34~+CD45~+CD105~-(HSCs)細胞擴增了5．2±0．4倍；CD34~-CD45~-CD105~+(MSCs)細胞擴增了13．9±1．2倍。培養(yǎng)結束后，通過自由沉降的方法分離UCB-HSCs和粘附在玻璃包被的苯乙烯聚合物(Glass coated styrenecopolymer，GCSC)微載體表面的UCB-MSCs。同時，細胞多向誘導分化及免疫表型分析結果顯示，粘附在GCSC微載體表面上的細胞能夠向骨、軟骨及脂肪細胞分化；并能夠表達間質細胞相關表面標志CD13，CD44，CD73和CD105，，而不表達造血細胞的相關表面標志CD34，CD45及HLA-DR，與骨髓MSCs相一致。該結果說明，采用RWVB并在添加細胞因子、基質細胞及微載體支持的條件下，能夠實現(xiàn)UCB-HSCs和UCB-MSCs的聯(lián)合共培養(yǎng)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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