【摘要】：背景和目的 人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒(Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV)是最早發(fā)現(xiàn)的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒,其在病毒分類中屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科腫瘤病毒亞科哺乳類C型病毒。人類嗜T淋巴細(xì)胞白血病病毒(HTLV)分為Ⅰ型和Ⅱ型。HTLV-Ⅰ可以導(dǎo)致成人T細(xì)胞白血病(adult T cell leukemia/lymphoma,ATL)、熱帶痙攣性麻痹癥/HTLV-Ⅰ相關(guān)的脊髓病(Tropical spastic paraparesis/human T-cell lymphotropicvirus typeⅠ-associated myelopathy,TSP/HAM)等疾病,HTLV-Ⅱ可能與T細(xì)胞增生紊亂等有關(guān)。HTLV-Ⅰ流行廣泛分布、局部地區(qū)高發(fā)。國內(nèi)10多個省市都發(fā)現(xiàn)了HTLV感染病例,并且發(fā)現(xiàn)在沿海的某些地區(qū)有集中流行。HTLV主要通過輸血、性接觸、哺乳等方式傳播。日本、美國、、法國及其它一些國家和地區(qū)已將其列為獻(xiàn)血員必檢項目。國內(nèi)使用的HTLV-Ⅰ篩檢試劑均為國外試劑,而制約國內(nèi)HTLV-Ⅰ篩檢試劑開發(fā)的瓶頸是其特異性抗原。為此,本實驗采用分子生物學(xué)技術(shù),利用原核和真核表達(dá)載體表達(dá)env重組抗原,為HTLV-Ⅰ篩檢試劑的研制奠定基礎(chǔ)。 實驗方法 分析HTLV-Ⅰenv基因和其編碼的gp46蛋白和gp21蛋白的氨基酸序列。選擇抗原決定簇豐富區(qū)(5915nt-6545nt)的630bp基因序列為目的基因。人工合成目的基因,在兩端加上BamHI和PstⅠ酶切位點。將目的基因片段分別克隆進(jìn)入原核表載體pQE80L和真核表達(dá)載體pcDNA4/HisMax-A。利用PCR擴(kuò)增和BamHI、PstⅠ酶切鑒定重組子pQE80L-env、pcDNA4/HisMax-A-env;然后行序列測定。將pQE80L-env轉(zhuǎn)入DH5α,1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá);親和層析純化原核表達(dá)重組env蛋白抗原。轉(zhuǎn)染pcDNA4/HisMax-A-env入NIH3T3,培養(yǎng)48h,親和層析純化真核表達(dá)重組env蛋白抗原。Western-blot檢測原核/真核表達(dá)重組env蛋白抗原的活性。利用ELISA方法測試兩種重組env蛋白抗原特異性。 實驗結(jié)果 1.PCR擴(kuò)增和BamHI、PstⅠ行酶切篩選得到重組子pQE80L-env和pcDNA4/HisMax-A-env。DNA序列測定證明重組子插入序列與設(shè)計一致。 2.原核表達(dá),SDS-PAGE分析顯示表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量約25KDa,與預(yù)期分子量相符。免疫印跡顯示,在約25KDa有一明顯特異印跡條帶,說明原核表達(dá)的重組蛋白具有HTLV-Ⅰenv抗原性。 3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48h,SDS-PAGE分析,可見相對分子質(zhì)量約為27KDa目的重組蛋白表達(dá),與預(yù)期融合蛋白大小相符。免疫印跡顯示,在約27KDa有明顯特異印跡條帶,說明真核表達(dá)的重組蛋白有HTLV-Ⅰenv抗原性。 4.原核表達(dá)純化的重組env抗原ELISA檢測結(jié)果:正常人、HIV陽性和HTLV-Ⅱ陽性的血清均為陰性;HTLV-Ⅰ陽性血清為強(qiáng)陽性。 5.真核表達(dá)純化的重組env抗原ELISA檢測與原核表達(dá)抗原一致,統(tǒng)計學(xué)比較,差異沒有顯著性差異(p＞0.05)。 結(jié)論 HTLV-Ⅰenv基因5915nt-6545nt區(qū),利用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到特異性HTLV-Ⅰ重組抗原;兩種重組抗原無顯著性差異,有望成為檢測試劑抗原。
[Abstract]:Background and objective Human T lymphocytic virus (Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV) is the earliest discovered human retrovirus, which belongs to mammalian type C virus of tumor virus subfamily of retroviridae. Human T-lymphoblastic leukemia virus (HTLV) is classified into type 鈪，

本文編號：2366527