發(fā)布時間：2018-12-06 09:11

【摘要】： 研究背景和目的 Tiam1是目前最受重視的Db1家族的鳥嘌呤核酸轉(zhuǎn)換因子(guaninenucleotide exchange factor,GEFs)之一,GEFs主要功能是調(diào)節(jié)Rho家族活性。Rho家族包括Rho、Rac和Cdc42,是Ras超家族的成員,它們均參與細胞骨架形成,在調(diào)節(jié)細胞骨架重組、細胞周期進程、基因轉(zhuǎn)錄、細胞遷移和粘附等細胞生命活動中發(fā)揮重要作用。早期研究表明Tiam1是誘導(dǎo)人類T細胞淋巴瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基因。Tiam1在體內(nèi)外均可特異性地激活Rho GTPase家族中的Rac1。新近研究發(fā)現(xiàn)Tiam1還可以直接與胞漿和胞膜上的蛋白質(zhì)相互作用,將它們耦合到Tiam1-Rac信號通路上,從而影響Rac信號通路的特異性。 Tiam1基因最初在小鼠T淋巴瘤細胞高侵襲變異株中分離鑒定。隨后,在T細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌和肺癌等腫瘤細胞中證實Tiam1具有明顯的促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的作用,是多種腫瘤的促癌基因。 目前,有關(guān)Tiam1的研究多基于體外細胞水平。由于體外和體內(nèi)基因功能研究尚存在一定差異,體外基因功能研究往往不能夠完全模擬基因在體作用形式和機制,因此,基因功能研究到一定階段,大多會引入轉(zhuǎn)基因(Transgene)或基因打靶(Gene targeting)等技術(shù)。建立表達或缺失特異目的基因的遺傳工程小鼠(Genetically modified mice,GMMs),整體動態(tài)觀察目的基因功能,是研究人類疾病發(fā)病機制、解答特定人群對某種疾病的易感性、識別藥靶、新藥篩選和療效判定等最為有效的手段。轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將某種特異性外源基因?qū)氲搅硪环N不具備這種性狀的生物內(nèi),并能使該生物表現(xiàn)插入基因特性的技術(shù),是將外源基因?qū)雱游矬w內(nèi)的重要方法,以此方法得到的能正常繁衍的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物(Transgenic animals)。 Malliri曾應(yīng)用在體RNA干擾技術(shù)建立了Tiam1沉默小鼠進行小鼠皮膚癌研究,結(jié)果顯示Tiam1沉默小鼠皮膚癌的發(fā)生率明顯降低,并且腫瘤進展緩慢,認為Tiam1在Ras誘導(dǎo)皮膚癌發(fā)生的啟動和進展階段發(fā)揮關(guān)鍵作用,這一效應(yīng)與Tiaml表達量有顯著相關(guān)性。目前尚沒有Tiam1轉(zhuǎn)基因動物模型。由于在正常組織中,Tiam1基因除了在正常腦、睪丸和皮膚中高表達外,在其他組織低表達或不表達,因此建立Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠,能夠為整體水平研究Tiam1基因功能和作用機制提供理想動物模型。 建立轉(zhuǎn)基因小鼠方法主要有四種,應(yīng)用比較多的方法是受精卵原核顯微注射技術(shù)和慢病毒感染技術(shù)。原核顯微注射法為目前最經(jīng)典的和最成熟制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法,被廣泛采用,但是顯微注射制備轉(zhuǎn)基因動物的效率很低。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種,可以感染分裂和非分裂細胞,并穩(wěn)定整合到細胞的基因組內(nèi),因此,它是一個極好的基因?qū)牍ぞ�。本研究所用的慢病毒載體是一個自我失活載體,攜帶一個GFP報告基因,即增強了載體的安全性,又提高了攜帶基因的檢出率。 本研究擬建立pCDF1-Tiam1-copGFP慢病毒表達載體,并轉(zhuǎn)染內(nèi)源性不表達Tiam1的結(jié)直腸癌HT29細胞株,細胞水平探討Tiam1的生物學(xué)功能,同時驗證所構(gòu)建慢病毒載體的正確性;通過慢病毒卵周隙顯微注射的轉(zhuǎn)基因方法制備Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠,并觀察其陽性表型,檢測增殖標(biāo)志物Ki-67,探討Tiam1在活體內(nèi)整體水平的生物學(xué)功能,并為Tiam1研究提供動物模型。 方法 1.pCDF1-Tiam1-copGFP慢病毒表達載體的構(gòu)建 利用載體克隆技術(shù)構(gòu)建pCDF1-Tiam1-copGFP慢病毒表達載體,應(yīng)用酶切及測序方法進行鑒定,將慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT病毒包裝細胞,收獲Tiam1慢病毒上清。 2.Tiam1表達對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)特性的影響 利用慢病毒感染技術(shù),將Tiam1導(dǎo)入內(nèi)源性不表達Tiam1基因的人結(jié)直腸癌HT29細胞株中,應(yīng)用RT-PCR、免疫組化及Western blot方法鑒定轉(zhuǎn)染后Tiam1基因在細胞中的表達情況,獲得穩(wěn)定表達Tiam1的細胞株HT29/Tiam1;觀察Tiam1基因轉(zhuǎn)染前后,細胞形態(tài)以及增殖、運動、侵襲能力的改變。 3.慢病毒載體法制備Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠 按標(biāo)準(zhǔn)程序準(zhǔn)備受精卵供體母鼠、種公鼠、結(jié)扎公鼠和假孕母鼠;將超速離心濃縮后的慢病毒注射入ICR小鼠受精卵的卵周隙中,將注射后狀態(tài)良好的受精卵移植進ICR假孕母鼠輸卵管內(nèi),并將假孕母鼠送回籠內(nèi)并觀察,直至恢復(fù)知覺,仔鼠一般19.5～20.0d后出生。 4.Tiam1轉(zhuǎn)基因首建鼠的篩選與鑒定 應(yīng)用PCR、PCR產(chǎn)物測序等方法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠目的基因的整合情況,以獲得Tiam1轉(zhuǎn)基因首建鼠。 5.Tiam1轉(zhuǎn)基因首建鼠繁殖傳代及轉(zhuǎn)基因遺傳和表達穩(wěn)定性檢測 將PCR陽性的首建鼠與野生型ICR鼠交配以傳代,獲得F_1后,用體視熒光顯微鏡檢測GFP在F_1臟器中的表達及分布;利用免疫組化法檢測GFP、Tiam1表達來進一步驗證上述結(jié)果,對其表達穩(wěn)定性做出判斷,進而間接判斷轉(zhuǎn)基因是否穩(wěn)定遺傳。 6.Tiam1轉(zhuǎn)基因陽性表型的檢測 對Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠各臟器組織進行包埋、制片,進行病理形態(tài)學(xué)觀察,應(yīng)用免疫組化檢測和分析轉(zhuǎn)基因小鼠的增殖標(biāo)志物Ki-67表達情況。 7.統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,細胞周期、平板克隆形成實驗、遷移實驗和侵襲實驗采用兩樣本t檢驗,體外增殖實驗和皮下成瘤實驗采用重復(fù)測量方差分析。 結(jié)果 1.所構(gòu)建慢病毒表達載體pCDF1-Tiam1-copGFP,經(jīng)EcorI酶切鑒定,可見6771bp載體和3800bpTiam1片段;目的片段測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上公布的Tiam1序列(NM_003253)進行Blast比對一致;將慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT病毒包裝細胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光,預(yù)示病毒包裝成功。 2.用收集的病毒上清感染內(nèi)源性不表達Tiam1的結(jié)直腸癌細胞株HT29,48h后倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,通過有限稀釋法獲得表達Tiam1的穩(wěn)定克隆HT29/Tiam1。 HE染色可見,HT29/Tiam1較HT29/mock細胞排列更為彌散,腺管樣結(jié)構(gòu)減少,細胞異型性更為明顯;細胞骨架染色及細胞掃描電鏡可見,HT29/Tiam1部分細胞由圓形、卵圓形向梭形轉(zhuǎn)變,細胞表面的偽足增多且更加寬厚,并出現(xiàn)纖長的偽足。 流式細胞術(shù)分析細胞周期,發(fā)現(xiàn)HT29/Tiam1及HT29/mock細胞的S期細胞平均比例分別為43.0%和31.4%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.546,P=0.000)。MTT法觀察表達Tiam1基因后細胞的增殖情況,HT29/mock細胞相比,HT29/Tiam1細胞的增殖能力增強,有統(tǒng)計學(xué)差異(F=177.125,P=0.000)。平板克隆形成實驗顯示HT29/Tiam1細胞的活力顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.222,P=0.032)。接種HT29/Tiam1細胞的裸鼠皮下腫瘤生長快于接種HT29/mock細胞的裸鼠,有統(tǒng)計學(xué)差異(F=53.040,P=0.002)。這些結(jié)果均說明Tiam1表達后能夠促進細胞體外增殖。 運動小室實驗證明,HT29/Tiam1和HT29/mock細胞的運動能力是HT29/mock細胞的1.5倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.832,P=0.001),說明Tiam1與細胞的運動遷移能力有關(guān)。 體外侵襲實驗證明,腫瘤細胞侵襲實驗24h后,HT29/Tiam1和HT29/mock細胞均穿透基底膜向下侵襲,在聚碳酸酯膜上可見變形的腫瘤細胞,HT29/Tiam1細胞侵襲能力是HT29/mock細胞的1.4倍,差異具有顯著性(t=3.779,P=0.005),說明Tiam1基因的表達增強了結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力。 3.慢病毒注射入628枚單細胞受精卵的卵周隙,存活胚胎556枚,共移植入33只假孕鼠,其中21只回種假孕鼠懷孕,受孕率為64%(21/33),共獲仔鼠76只,產(chǎn)仔率為14%(76/556)。PCR和PCR產(chǎn)物測序證明獲得Tiam1陽性首建鼠5只,首建鼠Tiam1整合率為7%; 4.體視熒光顯微鏡和冰凍切片的熒光觀察發(fā)現(xiàn),F_1代的Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)直腸、胃、肺、腎和睪丸五個臟器可見綠色熒光;免疫組化顯示GFP表達與Tiam1轉(zhuǎn)基因定位完全一致。提示外源基因不僅可以從一代向下一代穩(wěn)定傳遞,且能夠穩(wěn)定表達。 5.F_1代轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠的各臟器組織標(biāo)本的形態(tài)學(xué)觀察比較顯示,Tiam1過表達的五個臟器(結(jié)直腸、胃、肺、腎和睪丸)表現(xiàn)出顯著的增殖性改變:結(jié)直腸和胃腺上皮細胞增生,腺體排列密集、粘膜層增厚;肺支氣管上皮由假復(fù)層纖毛柱狀上皮轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)層纖毛柱狀上皮,細胞密集;腎小管上皮細胞增生,細胞排列緊密;睪丸初級精母細胞顯著增生,充滿曲細精管管腔,成熟精子數(shù)量減少。增殖標(biāo)志物Ki-67表達定位、強度與增殖性形態(tài)學(xué)改變一致。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建慢病毒表達載體pCDF1-Tiam1-copGFP,并獲得攜帶Tiam1和GFP融合基因的重組慢病毒,為Tiam1基因相關(guān)功能研究提供了優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體; 2.通過慢病毒感染人結(jié)直腸癌HT29細胞株,在細胞水平證明Tiam1是細胞增殖、運動和侵襲的促進基因; 3.運用慢病毒載體法成功建立Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠,并穩(wěn)定傳代,為Tiam1體內(nèi)研究提供理想的可視化動物模型。 4.Tiam1轉(zhuǎn)基因鼠的多個臟器(結(jié)直腸、胃、肺、腎和睪丸)Tiam1顯著過表達,相應(yīng)臟器細胞增殖活性顯著增強,其中結(jié)直腸增殖性改變尤為明顯,與體外細胞研究結(jié)果一致,表明Tiam1過表達可能與細胞增殖有關(guān),是促進細胞增殖的基因之一。 本研究的創(chuàng)新之處 1.首次成功建立可穩(wěn)定傳代的Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠,實現(xiàn)Tiam1基因的非損傷和可視化體內(nèi)示蹤; 2.首次利用Tiam1轉(zhuǎn)基因小鼠,在活體狀態(tài)下整體水平證明Tiam1能夠促進小鼠多臟器細胞增殖,表明Tiam1過表達可能與細胞增殖有關(guān),為細胞分裂增殖機制的研究提供了重要靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346;R-332

【共引文獻】

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本文編號：2365800