【摘要】： CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)是一種七次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體,主要表達(dá)于活化/記憶T細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等表面。Loetscher等于1996年首次從人CD4+ T細(xì)胞來源的cDNA文庫中克隆出人CXCR3基因,基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1104bp,編碼368個(gè)氨基酸,蛋白分子量為40.659 kD。目前已發(fā)現(xiàn)三種剪接變體,分別為CXCR3-A(即通常所說的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR3-alt;有三種CXC趨化因子配體與可之結(jié)合,分別為CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC。近年研究發(fā)現(xiàn),CXCR3在一些惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),通過受體-配體相互作用介導(dǎo)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。因此,本研究旨在克隆人和小鼠CXCR3基因,建立穩(wěn)定表達(dá)人/小鼠CXCR3分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3,研究L929-huCXCR3和L929-mCXCR3在CXCR3配體作用下的遷移能力。以L929-huCXCR3作為免疫原和篩選細(xì)胞,建立能持續(xù)分泌鼠抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;以單克隆抗體作為工具,研究CXCR3信號(hào)通路對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的影響。 第一部分人及小鼠CXCR3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定 【目的】克隆人及小鼠CXCR3編碼區(qū)全長(zhǎng)基因,獲得穩(wěn)定表達(dá)人/小鼠CXCR3膜型分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3 ;研究L929-huCXCR3和L929-mCXCR3在CXCR3配體介導(dǎo)下的遷移效應(yīng)。 【方法】采用RT-PCR方法從活化的人外周血T淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增人CXCR3基因;同樣方法從經(jīng)Con A體內(nèi)刺激、IL-2體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠脾臟和胸腺細(xì)胞擴(kuò)增小鼠CXCR3基因,分別插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-term。將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-term/huCXCR3和pEGZ-term/mCXCR3分別與兩輔助病毒載體脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T,收集含完整逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清,用其感染L929細(xì)胞,重復(fù)感染3次,經(jīng)Zeocin加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)人/小鼠CXCR3分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3。采用免疫熒光和RT-PCR方法對(duì)L929-huCXCR3和L929-mCXCR3細(xì)胞進(jìn)行鑒定;應(yīng)用Transwell隔離小室系統(tǒng)研究基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在Mig、IP-10及I-TAC作用下的遷移效應(yīng)。 【結(jié)果】獲得了穩(wěn)定表達(dá)人/小鼠CXCR3膜型分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3,兩種細(xì)胞內(nèi)GFP和膜表面人/小鼠CXCR3分子的陽性表達(dá)率均在95.0%以上。L929-huCXCR3在人CXCR3配體的作用下可發(fā)生定向遷移,但所需的起始濃度不同、同等濃度下三種配體介導(dǎo)的遷移率也不同;L929-mCXCR3在50 ng/mL小鼠IP-10的作用下可發(fā)生定向遷移,并且抗小鼠CXCR3抗體對(duì)L929-mCXCR3的遷移具有抑制作用。 【結(jié)論】人及小鼠CXCR3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3和L929-mCXCR3的建立,為研究CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物學(xué)功能、腫瘤轉(zhuǎn)移模型的建立及抗人/小鼠CXCR3單克隆抗體的研制奠定了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。 第二部分鼠抗人CXCR3單克隆抗體的研制及生物學(xué)功能研究 【目的】獲得持續(xù)分泌鼠抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;以鼠抗人CXCR3單克隆抗體作為工具,研究人CXCR3分子的表達(dá)特性及CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)L929-huCXCR3和結(jié)腸癌細(xì)胞株的遷移及增殖的影響。 【方法】以高表達(dá)人CXCR3膜型分子的L929-huCXCR3細(xì)胞作為免疫原免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴細(xì)胞雜交技術(shù),將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與同種系小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。以L929-huCXCR3作為篩選細(xì)胞,轉(zhuǎn)染空載體的L929-mock細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞,采用間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù),篩選能持續(xù)分泌抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞類快速定性試紙法、間接免疫熒光以及Western blot對(duì)所獲得的雜交瘤細(xì)胞株和單抗進(jìn)行鑒定。用間接免疫熒光法分析CXCR3分子在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá);Transwell隔離小室檢測(cè)單抗對(duì)L929-huCXCR3和結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCT116及HT29遷移的影響;MTT法分析單抗對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205增殖的影響。 【結(jié)果】獲得了1株能持續(xù)分泌鼠抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為9B5。經(jīng)快速定性試紙分析顯示,該單抗重鏈為IgG1亞類,輕鏈為κ鏈;間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,單抗9B5可識(shí)別活化T淋巴細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCT116及HT-29表面的CXCR3分子,并且可用于Western blot檢測(cè)。通過阻斷CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),單抗9B5可抑制L929-huCXCR3細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo205、HCT116和HT29的定向遷移及IP-10對(duì)Colo205的促增殖作用。 【結(jié)論】成功獲得了1株能持續(xù)分泌鼠抗人CXCR3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,為研究CXCR3的表達(dá)特性及深入探討CXCR3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過程中的作用及機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ),并且有望為治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路和新型藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2365105