【摘要】：來源于胚胎內(nèi)細胞群(inner cell mass, ICM)的ES細胞(embryonic stem cells))和來源于原始生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)的EG細胞(embryonic germ cells)因其能在體外無限增殖,并具有多向分化潛能和種系嵌合能力,而成為生命科學領域倍受關注的焦點。小鼠胚胎干細胞有著重要而廣闊的研究價值,尤其在哺乳類動物發(fā)育生物學研究上有著其它種族胚胎干細胞難以替代的優(yōu)勢和重要地位。小鼠胚胎干細胞是哺乳類動物發(fā)育生物學研究的理想體外模型,通過小鼠胚胎干細胞體外培養(yǎng)平臺的建立,尋找哺乳動物胚胎發(fā)育決定和細胞定向譜系分化等重要生物學調(diào)控事件中的關鍵因子,是人類干細胞工程今后應用于臨床疾病治療的重要基礎研究工作。此外,PGCs和EG細胞作為“干細胞之母”,對于研究生殖細胞發(fā)育、分化、成熟的調(diào)節(jié)機制以及生殖系腫瘤的發(fā)生機制有重要理論意義。發(fā)育生物學和干細胞應用兩個領域相輔相成,共同的焦點是多能干細胞的自我更新機制和分化機制。多年來體內(nèi)ICM、PGCs以及體外ES細胞、EG細胞保持多能性和自我更新的機制一直是科研工作研究熱點,但迄今為止仍不清楚,而由于EG細胞分離培養(yǎng)難度相對較大,目前對PGCs及EG細胞的研究更為滯后。早期胚胎發(fā)育和ES細胞自我更新及分化機制的研究結(jié)果表明：多能干細胞特異轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog以及HMG-box家族轉(zhuǎn)錄因子成員Sox2位于細胞全能性調(diào)控網(wǎng)絡的頂端,共同調(diào)節(jié)與自我更新、多能性以及分化相關的下游基因,它們是保持內(nèi)細胞群以及ES細胞自我更新和多潛能性的核心物質(zhì)。各種紛繁復雜的外源信號最終正是作用于上述多能干細胞標志基因,從而決定細胞的多能性表型。PGCs是指在進入與體細胞有密切接觸的生殖腺成為真正的生殖細胞之前,短暫存在于胚胎的雙倍體生殖細胞前體。PGCs具有雙重身份和雙重研究價值：其一,在體內(nèi)PGCs能定向發(fā)育為成熟生殖細胞配子,毫無疑問它是生殖細胞的前體細胞；其二,體外適宜條件下PGCs能長期培養(yǎng)稱為EG細胞,它和ES細胞同屬于胚胎干細胞。探明PGCs增殖、定向分化形成生殖干細胞的發(fā)育機制對于生殖系統(tǒng)發(fā)育異常的診療以及干細胞工程的應用具有雙重指導意義。Nanog是發(fā)育生物學和干細胞生物學領域的新興研究熱點,但現(xiàn)有研究多集中于Nanog對早期胚胎以及ES細胞的多能性維持。為了進一步探索ES細胞自我更新分子調(diào)控機制以及探討Nanog對胚胎發(fā)育過程中PGCs的調(diào)控機理,我們進行了以下研究：1.比較小鼠胚胎成纖堆細胞(Mouse embryonic fibroblasts, MEFs)和永生化的STO細胞兩種飼養(yǎng)層細胞的生物學特性,建立適宜的胚胎干細胞飼養(yǎng)層體系。2.建立ES細胞和EG細胞體外培養(yǎng)平臺。3.觀察分析Nanog在小鼠原始生殖細胞發(fā)育過程中的表達譜。4.通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)介導Nanog基因沉默觀察對EG細胞的影響。上述研究內(nèi)容簡介如下：1、MEFs和STO飼養(yǎng)層體系的建立：本研究以13.5dpc-14.5dpc胎鼠為材料,采用酶消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法,成功分離培養(yǎng)獲得MEFs。MTT生長曲線測定和FACS細胞周期時相測定顯示：STO細胞增殖較MEFs快,需要傳代的周期短。MTT結(jié)果顯示：絲裂霉素C10μg/ml作用2.5h～3.5h、20 μ g/ml作用1.5h～2.5h能有效抑制MEFs的有絲分裂,MEFs飼養(yǎng)層在7d內(nèi)能完全維持在穩(wěn)定水平。絲裂霉素C5μg/ml-10μg/ml作用1.5h～2.5h能有效抑制STO細胞的有絲分裂,STO飼養(yǎng)層在5d內(nèi)相對穩(wěn)定。根據(jù)生長特性,ES細胞原代分離培養(yǎng)更適宜選擇MEF作為飼養(yǎng)層。集落計數(shù)表明MEFs和STO飼養(yǎng)層對EG細胞克隆形成無顯著性差異,而FACS檢測表明：STO細胞表達粘附分子CDPC44熒光強度明顯高于MEF,提示STO細胞較MEFs可能有粘附力更強的優(yōu)勢,適宜作EG細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層,但STO細胞對EG細胞核型異常有一定影響。本研究從優(yōu)化實驗條件的角度出發(fā),探討兩種細胞來源飼養(yǎng)層在本實驗室的適宜應用條件,為分離克隆胚胎干細胞奠定了可靠的實驗基礎。2、小鼠ES、EG細胞的體外分離、純化、培養(yǎng)與鑒定：本研究采用全胚培養(yǎng)法,以3.5dpc小鼠囊胚ICM為來源分離培養(yǎng)ES細胞,以MEFs為飼養(yǎng)層,5d左右ICM增殖形成圓柱狀結(jié)構(gòu),ICM細胞團在新的飼養(yǎng)層上初次傳代培養(yǎng),獲得ES細胞集落,集落能進行傳代培養(yǎng),傳代ES細胞具有高度堿性磷酸酶活性,表達SSEA-1抗原,但未能完成大規(guī)模擴增。以11.5dpc小鼠胚胎生殖嵴為來源,酶消化結(jié)合機械分離法分離培養(yǎng)PGCs, PGCs在STO飼養(yǎng)層上能擴增形成典型EG細胞集落,集落能穩(wěn)定傳代。經(jīng)堿性磷酸酶組織化學、SSEA-1免疫組化、Oct4免疫熒光染色及Nanog RT-PCR鑒定傳代培養(yǎng)的EG細胞能維持未分化狀態(tài)；體外培養(yǎng)可分化形成囊狀類胚體,提示EG細胞具有多向分化潛能；核型分析顯示EG細胞能保持較高的正常核型水平。本研究成功建立了EG細胞體外培養(yǎng)平臺,為進一步研究胚胎干細胞自我更新重要相關因子對胚胎生殖細胞的調(diào)控機制奠定了基礎。而對于來源細胞數(shù)量極少的ES細胞的大量擴增還有待進一步探索。3、Nanog在小鼠原始生殖細胞發(fā)育過程中的的時空表達：本研究采用胚胎連續(xù)石蠟切片、免疫熒光方法定性研究Nanog在PGCs的表達,結(jié)果表明：7.5dpc、8.5dpc胎鼠尿囊,9.5dpc、10.5dpc胎鼠后腸及背腸系膜,11.5dpc胚胎原始生殖嵴及周圍腸系膜內(nèi)均可見Nanog陽性表達。12.5dpc-14.5dpc胚胎生殖腺內(nèi)也可見Nanog表達陽性細胞,但隨胚胎胎齡增大,熒光強度逐漸減弱,15.5dpc胚胎Nanog表達陰性。進一步采用免疫熒光定量分析性腺分化前后11.5dpc～15.5dpc胎鼠PGCs中Nano g的表達變化,激光共聚焦分析結(jié)果表明：11.5dpc胎鼠PGCs中Nanog表達陽性率和熒光強度最強。雌性和雄性胎鼠分別于12.5d、13.5d后Nanog表達急劇下降。綜合以上結(jié)果表明：Nanog在增殖的小鼠PGCs中穩(wěn)定表達,在分化性腺中表達下降。提示Nanog可能與PGCs的未分化狀態(tài)維持及分化有關；Nanog與Oct4表達譜的相似性提示這兩個因子功能的相關性。4、RNAi介導Nanog基因沉默對EG細胞的影響研究：本研究在觀察分析小鼠體內(nèi)PGCs發(fā)育過程中N anog表達變化的基礎上,進一步采用RNA干擾技術(shù)深入研究Nanog對EG細胞的影響。免疫熒光和半定量RT-PCR結(jié)果表明化學合成siRNA在48h內(nèi)能有效抑制Nanog表達。轉(zhuǎn)染Nanog siRNA48、時后,典型未分化EG細胞集落數(shù)量顯著性下降,表明Nanog是維持EG細胞自我更新保持未分化狀態(tài)的關鍵因子。半定量RT-PCR結(jié)果表明伴隨Nanog表達下調(diào),生殖細胞特異基因vasa表達顯著性上升,減數(shù)分裂標志SCP3表達陽性,提示Nanog表達下調(diào)與生殖細胞分化啟動相關。通過透射電鏡和TUNEL法檢測,RNAi抑制Nanog表達還可導致EG細胞發(fā)生凋亡,提示多能性干細胞特有的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子對抑制多能干細胞凋亡有重要作用。結(jié)合本研究第三部分Nanog在增殖PGCs中穩(wěn)定表達,在分化性腺中表達下降的體內(nèi)實驗結(jié)果,本研究表明Nanog對發(fā)育過程中PGCs未分化狀態(tài)維持、性腺分化起著關鍵性作用。綜上所述,本研究采用現(xiàn)代生物學技術(shù)在比較兩種飼養(yǎng)層細胞生物學特性,優(yōu)化飼養(yǎng)層體系的基礎上建立了ES細胞和EG細胞體外培養(yǎng)平臺。結(jié)合Nanog在體內(nèi)PGCs的表達譜分析,我們以EG細胞模擬體內(nèi)的PGCs,通過化學合成siRNA沉默Nanog的方式進一步探討了Nanog對發(fā)育過程中PGCs的可能調(diào)控機制,從發(fā)育生物學的角度對PGCsEG細胞的自我更新及分化機制進行了有益的探索。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R321

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本文編號：2364889