【摘要】：來(lái)源于胚胎內(nèi)細(xì)胞群(inner cell mass, ICM)的ES細(xì)胞(embryonic stem cells))和來(lái)源于原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)的EG細(xì)胞(embryonic germ cells)因其能在體外無(wú)限增殖,并具有多向分化潛能和種系嵌合能力,而成為生命科學(xué)領(lǐng)域倍受關(guān)注的焦點(diǎn)。小鼠胚胎干細(xì)胞有著重要而廣闊的研究?jī)r(jià)值,尤其在哺乳類動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究上有著其它種族胚胎干細(xì)胞難以替代的優(yōu)勢(shì)和重要地位。小鼠胚胎干細(xì)胞是哺乳類動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究的理想體外模型,通過(guò)小鼠胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)平臺(tái)的建立,尋找哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育決定和細(xì)胞定向譜系分化等重要生物學(xué)調(diào)控事件中的關(guān)鍵因子,是人類干細(xì)胞工程今后應(yīng)用于臨床疾病治療的重要基礎(chǔ)研究工作。此外,PGCs和EG細(xì)胞作為“干細(xì)胞之母”,對(duì)于研究生殖細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制以及生殖系腫瘤的發(fā)生機(jī)制有重要理論意義。發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞應(yīng)用兩個(gè)領(lǐng)域相輔相成,共同的焦點(diǎn)是多能干細(xì)胞的自我更新機(jī)制和分化機(jī)制。多年來(lái)體內(nèi)ICM、PGCs以及體外ES細(xì)胞、EG細(xì)胞保持多能性和自我更新的機(jī)制一直是科研工作研究熱點(diǎn),但迄今為止仍不清楚,而由于EG細(xì)胞分離培養(yǎng)難度相對(duì)較大,目前對(duì)PGCs及EG細(xì)胞的研究更為滯后。早期胚胎發(fā)育和ES細(xì)胞自我更新及分化機(jī)制的研究結(jié)果表明：多能干細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog以及HMG-box家族轉(zhuǎn)錄因子成員Sox2位于細(xì)胞全能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端,共同調(diào)節(jié)與自我更新、多能性以及分化相關(guān)的下游基因,它們是保持內(nèi)細(xì)胞群以及ES細(xì)胞自我更新和多潛能性的核心物質(zhì)。各種紛繁復(fù)雜的外源信號(hào)最終正是作用于上述多能干細(xì)胞標(biāo)志基因,從而決定細(xì)胞的多能性表型。PGCs是指在進(jìn)入與體細(xì)胞有密切接觸的生殖腺成為真正的生殖細(xì)胞之前,短暫存在于胚胎的雙倍體生殖細(xì)胞前體。PGCs具有雙重身份和雙重研究?jī)r(jià)值：其一,在體內(nèi)PGCs能定向發(fā)育為成熟生殖細(xì)胞配子,毫無(wú)疑問(wèn)它是生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞；其二,體外適宜條件下PGCs能長(zhǎng)期培養(yǎng)稱為EG細(xì)胞,它和ES細(xì)胞同屬于胚胎干細(xì)胞。探明PGCs增殖、定向分化形成生殖干細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制對(duì)于生殖系統(tǒng)發(fā)育異常的診療以及干細(xì)胞工程的應(yīng)用具有雙重指導(dǎo)意義。Nanog是發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的新興研究熱點(diǎn),但現(xiàn)有研究多集中于Nanog對(duì)早期胚胎以及ES細(xì)胞的多能性維持。為了進(jìn)一步探索ES細(xì)胞自我更新分子調(diào)控機(jī)制以及探討Nanog對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中PGCs的調(diào)控機(jī)理,我們進(jìn)行了以下研究：1.比較小鼠胚胎成纖堆細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblasts, MEFs)和永生化的STO細(xì)胞兩種飼養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)特性,建立適宜的胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層體系。2.建立ES細(xì)胞和EG細(xì)胞體外培養(yǎng)平臺(tái)。3.觀察分析Nanog在小鼠原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)譜。4.通過(guò)RNA干擾(RNA interference, RNAi)介導(dǎo)Nanog基因沉默觀察對(duì)EG細(xì)胞的影響。上述研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介如下：1、MEFs和STO飼養(yǎng)層體系的建立：本研究以13.5dpc-14.5dpc胎鼠為材料,采用酶消化結(jié)合組織塊培養(yǎng)法,成功分離培養(yǎng)獲得MEFs。MTT生長(zhǎng)曲線測(cè)定和FACS細(xì)胞周期時(shí)相測(cè)定顯示：STO細(xì)胞增殖較MEFs快,需要傳代的周期短。MTT結(jié)果顯示：絲裂霉素C10μg/ml作用2.5h～3.5h、20 μ g/ml作用1.5h～2.5h能有效抑制MEFs的有絲分裂,MEFs飼養(yǎng)層在7d內(nèi)能完全維持在穩(wěn)定水平。絲裂霉素C5μg/ml-10μg/ml作用1.5h～2.5h能有效抑制STO細(xì)胞的有絲分裂,STO飼養(yǎng)層在5d內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。根據(jù)生長(zhǎng)特性,ES細(xì)胞原代分離培養(yǎng)更適宜選擇MEF作為飼養(yǎng)層。集落計(jì)數(shù)表明MEFs和STO飼養(yǎng)層對(duì)EG細(xì)胞克隆形成無(wú)顯著性差異,而FACS檢測(cè)表明：STO細(xì)胞表達(dá)粘附分子CDPC44熒光強(qiáng)度明顯高于MEF,提示STO細(xì)胞較MEFs可能有粘附力更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),適宜作EG細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層,但STO細(xì)胞對(duì)EG細(xì)胞核型異常有一定影響。本研究從優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的角度出發(fā),探討兩種細(xì)胞來(lái)源飼養(yǎng)層在本實(shí)驗(yàn)室的適宜應(yīng)用條件,為分離克隆胚胎干細(xì)胞奠定了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2、小鼠ES、EG細(xì)胞的體外分離、純化、培養(yǎng)與鑒定：本研究采用全胚培養(yǎng)法,以3.5dpc小鼠囊胚ICM為來(lái)源分離培養(yǎng)ES細(xì)胞,以MEFs為飼養(yǎng)層,5d左右ICM增殖形成圓柱狀結(jié)構(gòu),ICM細(xì)胞團(tuán)在新的飼養(yǎng)層上初次傳代培養(yǎng),獲得ES細(xì)胞集落,集落能進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代ES細(xì)胞具有高度堿性磷酸酶活性,表達(dá)SSEA-1抗原,但未能完成大規(guī)模擴(kuò)增。以11.5dpc小鼠胚胎生殖嵴為來(lái)源,酶消化結(jié)合機(jī)械分離法分離培養(yǎng)PGCs, PGCs在STO飼養(yǎng)層上能擴(kuò)增形成典型EG細(xì)胞集落,集落能穩(wěn)定傳代。經(jīng)堿性磷酸酶組織化學(xué)、SSEA-1免疫組化、Oct4免疫熒光染色及Nanog RT-PCR鑒定傳代培養(yǎng)的EG細(xì)胞能維持未分化狀態(tài)；體外培養(yǎng)可分化形成囊狀類胚體,提示EG細(xì)胞具有多向分化潛能；核型分析顯示EG細(xì)胞能保持較高的正常核型水平。本研究成功建立了EG細(xì)胞體外培養(yǎng)平臺(tái),為進(jìn)一步研究胚胎干細(xì)胞自我更新重要相關(guān)因子對(duì)胚胎生殖細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。而對(duì)于來(lái)源細(xì)胞數(shù)量極少的ES細(xì)胞的大量擴(kuò)增還有待進(jìn)一步探索。3、Nanog在小鼠原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的的時(shí)空表達(dá)：本研究采用胚胎連續(xù)石蠟切片、免疫熒光方法定性研究Nanog在PGCs的表達(dá),結(jié)果表明：7.5dpc、8.5dpc胎鼠尿囊,9.5dpc、10.5dpc胎鼠后腸及背腸系膜,11.5dpc胚胎原始生殖嵴及周圍腸系膜內(nèi)均可見(jiàn)Nanog陽(yáng)性表達(dá)。12.5dpc-14.5dpc胚胎生殖腺內(nèi)也可見(jiàn)Nanog表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞,但隨胚胎胎齡增大,熒光強(qiáng)度逐漸減弱,15.5dpc胚胎Nanog表達(dá)陰性。進(jìn)一步采用免疫熒光定量分析性腺分化前后11.5dpc～15.5dpc胎鼠PGCs中Nano g的表達(dá)變化,激光共聚焦分析結(jié)果表明：11.5dpc胎鼠PGCs中Nanog表達(dá)陽(yáng)性率和熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。雌性和雄性胎鼠分別于12.5d、13.5d后Nanog表達(dá)急劇下降。綜合以上結(jié)果表明：Nanog在增殖的小鼠PGCs中穩(wěn)定表達(dá),在分化性腺中表達(dá)下降。提示Nanog可能與PGCs的未分化狀態(tài)維持及分化有關(guān)；Nanog與Oct4表達(dá)譜的相似性提示這兩個(gè)因子功能的相關(guān)性。4、RNAi介導(dǎo)Nanog基因沉默對(duì)EG細(xì)胞的影響研究：本研究在觀察分析小鼠體內(nèi)PGCs發(fā)育過(guò)程中N anog表達(dá)變化的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)深入研究Nanog對(duì)EG細(xì)胞的影響。免疫熒光和半定量RT-PCR結(jié)果表明化學(xué)合成siRNA在48h內(nèi)能有效抑制Nanog表達(dá)。轉(zhuǎn)染Nanog siRNA48、時(shí)后,典型未分化EG細(xì)胞集落數(shù)量顯著性下降,表明Nanog是維持EG細(xì)胞自我更新保持未分化狀態(tài)的關(guān)鍵因子。半定量RT-PCR結(jié)果表明伴隨Nanog表達(dá)下調(diào),生殖細(xì)胞特異基因vasa表達(dá)顯著性上升,減數(shù)分裂標(biāo)志SCP3表達(dá)陽(yáng)性,提示Nanog表達(dá)下調(diào)與生殖細(xì)胞分化啟動(dòng)相關(guān)。通過(guò)透射電鏡和TUNEL法檢測(cè),RNAi抑制Nanog表達(dá)還可導(dǎo)致EG細(xì)胞發(fā)生凋亡,提示多能性干細(xì)胞特有的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子對(duì)抑制多能干細(xì)胞凋亡有重要作用。結(jié)合本研究第三部分Nanog在增殖PGCs中穩(wěn)定表達(dá),在分化性腺中表達(dá)下降的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究表明Nanog對(duì)發(fā)育過(guò)程中PGCs未分化狀態(tài)維持、性腺分化起著關(guān)鍵性作用。綜上所述,本研究采用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)在比較兩種飼養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)特性,優(yōu)化飼養(yǎng)層體系的基礎(chǔ)上建立了ES細(xì)胞和EG細(xì)胞體外培養(yǎng)平臺(tái)。結(jié)合Nanog在體內(nèi)PGCs的表達(dá)譜分析,我們以EG細(xì)胞模擬體內(nèi)的PGCs,通過(guò)化學(xué)合成siRNA沉默Nanog的方式進(jìn)一步探討了Nanog對(duì)發(fā)育過(guò)程中PGCs的可能調(diào)控機(jī)制,從發(fā)育生物學(xué)的角度對(duì)PGCsEG細(xì)胞的自我更新及分化機(jī)制進(jìn)行了有益的探索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：2364889