發(fā)布時(shí)間：2018-11-29 09:06

【摘要】： 研究目的: 應(yīng)用共培養(yǎng)方法體外誘導(dǎo)脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)向表皮干細(xì)胞(ESCs)分化,探討其作為組織工程化皮膚種子細(xì)胞的可行性。 研究方法: 1.選用兔齡3～4月大白兔,用貼壁法及Ⅰ型膠原酶法從脂肪組織中分離出細(xì)胞,進(jìn)行體外長期傳代及大量增殖培養(yǎng),并觀察及檢測(cè)其生物學(xué)特性,以鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)。 2.復(fù)蘇人HaCaT細(xì)胞株,并體外擴(kuò)增培養(yǎng)。 3.實(shí)驗(yàn)分組:①共培養(yǎng)3天的ADSCs;②共培養(yǎng)7天的ADSCs;③第三代ADSCs。采用插入式細(xì)胞培養(yǎng)器(Transwell)與六孔板來構(gòu)建體外共培養(yǎng)模型,將HaCaT細(xì)胞和ADSCs分別種于上室和下室內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)。對(duì)共培養(yǎng)后的ADSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定,對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行角蛋白K19,Pan-CK和β1整合素三個(gè)指標(biāo)的免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè),并用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 研究結(jié)果: 1.ADSCs生物學(xué)特性:①原代及傳代的兔ADSCs均呈長梭形或三角形貼壁生長,形態(tài)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)相似。②傳代的兔ADSCs生長曲線呈“S”形,群體倍增時(shí)間為22h～25h。③免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD29,CD44表達(dá)陽性;而CD34,CD45表達(dá)陰性。 2.共培養(yǎng)后的ADSCs:①在形態(tài)上,共培養(yǎng)后的ADSCs細(xì)胞體積變大,橫徑變粗,由原來的細(xì)長梭型變成粗長梭型或短棒狀,形態(tài)向表皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)化,并處于未成熟期;②在免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中,共培養(yǎng)后的ADSCs均表達(dá)角蛋白K19,Pan-CK和β1整合素陽性,共培養(yǎng)7天的較共培養(yǎng)3天的ADSCs表達(dá)抗體陽性率增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果表明共培養(yǎng)后的ADSCs為第三代ADSCs、表皮干細(xì)胞(ESCs)和暫時(shí)增殖細(xì)胞(TA細(xì)胞)的混合體。 研究結(jié)論: 1.膠原酶消化法可以獲得純度較高的ADSCs。 2.兔ADSCs與人HaCaT細(xì)胞體外共培養(yǎng),可誘導(dǎo)向ESCs分化。 3.用Transwell體外構(gòu)建HaCaT與ADSCs共培養(yǎng)模型,轉(zhuǎn)化陽性率較高、避免交叉反應(yīng)、簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。
[Abstract]:Aim: to induce the differentiation of adipose stem cells (ADSCs) into epidermal stem cells (ESCs) by co-culture in vitro, and to explore the feasibility of inducing adipose stem cells (ADSCs) to differentiate into epidermal stem cells (ESCs) as tissue engineered skin seed cells. Methods: 1. Three to four months old white rabbits were used to isolate the cells from adipose tissue by adherent method and type I collagenase method. The cells were subcultured and cultured in vitro for a long time, and their biological characteristics were observed and detected. Identification of Adipose-derived Stem cells (ADSCs). From cultured cells 2. Human HaCaT cells were resuscitated and cultured in vitro. 3. Experimental groups: 1 the third generation ADSCs. of ADSCs;3 co-cultured for 7 days with ADSCs;2 co-cultured for 3 days The co-culture model of HaCaT cells and ADSCs cells was established in vitro by inserting (Transwell) and six pore plates. HaCaT cells and ADSCs cells were cocultured in the upper chamber and the lower chamber, respectively. Morphological observation and identification of co-cultured ADSCs were carried out. Keratin K19 Pan-CK and 尾 1 integrin were detected by immunocytology in three groups of cells. SPSS15.0 was used for statistical analysis. Results: the biological characteristics of 1.ADSCs were as follows: (1) Rabbit ADSCs in primary generation and passage had long fusiform or triangular adherent growth, which was similar to (BMSCs) in bone marrow mesenchymal stem cells, and the growth curve of rabbit ADSCs in passage was "S" shape. The population doubling time was 22h~25h.3 immunocytochemistry to detect the positive expression of CD29,CD44. The expression of CD34,CD45 was negative. 2. In morphology of co-cultured ADSCs:1, the volume and transverse diameter of co-cultured ADSCs cells became larger and thicker, from the original slender spindle type to the coarse spindle type or short rod type. The morphology of the ADSCs cells transformed to epidermal cell line and was in immature stage. 2in immunocytochemistry, the expression of keratin K19Pan-CK and 尾 1 integrin in ADSCs was positive, and the positive rate of ADSCs expression in co-cultured for 7 days was higher than that in co-cultured for 3 days (P < 0. 05). The results showed that the co-cultured ADSCs was a mixture of the third generation ADSCs, epidermal stem cells (ESCs) and temporary proliferative cells (TA cells). Conclusion: 1. High purity ADSCs. can be obtained by collagenase digestion 2. Rabbit ADSCs and human HaCaT cells can be induced to differentiate into ESCs by co-culture in vitro. 3. The co-culture model of HaCaT and ADSCs was constructed with Transwell in vitro. The positive rate of transformation was higher, the cross reaction was avoided, and it was simple and economical.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2364577