【摘要】： 肝卵圓細胞是目前公認的肝干/祖細胞之一,具有在體外分化成成熟的肝細胞和膽管細胞的能力。WB-F344細胞是從Fischer雄性大鼠肝臟分離出來的卵圓細胞,常被作為進行體外研究肝干/祖細胞向成熟肝細胞或者膽管細胞分化的模型。Matrigel是一種從小鼠肉瘤中抽提得到的人工合成的可溶性間質(zhì)膜蛋白復合物,它能夠模擬體內(nèi)間質(zhì)微環(huán)境,促進各種管狀結(jié)構(gòu)的形成。有研究發(fā)現(xiàn)當WB-F344細胞接種于Matrigel上之后,細胞能夠被誘導分化成為膽管細胞,細胞開始收縮形成管腔樣結(jié)構(gòu)并沿著結(jié)構(gòu)拉伸。與此同時發(fā)現(xiàn)膽管系基因如Yp、Aquaporin、CK19等特異性表達。表皮形態(tài)發(fā)生素epimorphin(EPM)是一個高度保守的間質(zhì)細胞表面膜蛋白,在哺乳動物中廣泛表達,在腺管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)EPM也能誘導WB-F344細胞向膽管細胞分化并且對WB-F344細胞內(nèi)的應力纖維的排列有很大影響。在Matrigel和EPM誘導的WB-F344細胞向膽管細胞分化的過程中RhoA的表達活性均發(fā)生上調(diào)。小G蛋白RhoA是位于細胞內(nèi)的重要細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白,參與控制細胞的變形、運動、粘附及細胞的分裂、惡性腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等。我們初步的研究結(jié)果也表明RhoA在Matrigel以及EPM誘導的WB-F344細胞分化過程中發(fā)揮了重要的作用。本課題主要研究細胞外基質(zhì)Matrigel、細胞外因子EPM以及細胞內(nèi)信號分子RhoA如何有機結(jié)合誘導肝卵圓細胞WB-F344細胞向膽管細胞分化。 我們首先成功建立Matrigel誘導WB-F344細胞向膽管細胞分化的模型,觀察WB-F344細胞在誘導分化過程中的形態(tài)變化、膽管細胞相關基因表達變化情況以及RhoA的表達變化情況。與此同時建立EPM-PT67、WB-F344細胞共培養(yǎng)模型,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將EPM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進PT67細胞中并通過極限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達EPM的PT67細胞。通過絲裂霉素處理EPM-PT67細胞和PT67細胞使其停止生長并將其作為滋養(yǎng)層細胞后,接種WB細胞進行共培養(yǎng),觀察WB細胞的形態(tài)學變化、膽管系基因和蛋白的表達變化情況以及RhoA的表達情況。在上述工作的基礎上,利用pfu點突變技術構(gòu)建了RhoA基因的始終活性突變體CA(Constitutively Active)和始終失活突變體DN(Dominant Negative),經(jīng)測序鑒定正確。之后將基因突變體進行慢病毒包裝,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進WB-F344細胞中,同時利用空慢病毒載體轉(zhuǎn)染進細胞做對照,觀察RhoA CA WB細胞、RhoA DN WB細胞、對照細胞的形態(tài)學變化以及膽管系基因的表達變化情況。電鏡觀察WB-F344細胞的超微結(jié)構(gòu),尋找膽管細胞、肝細胞的特征性超微結(jié)構(gòu),進一步判斷RhoA突變后細胞的分化趨勢。最后進行RhoA信號通路的探索和定位,通過加入RhoA下游信號分子ROCK的抑制劑Y27632觀察細胞形態(tài)的變化等來確定ROCK在該過程中的作用,同時還觀察細胞內(nèi)應力纖維束的排列,進一步明確RhoA-ROCK的作用;與此同時提取RhoA CA、RhoA DN、對照三種WB細胞的蛋白,利用蛋白電泳技術觀察EPM信號通路上的FAK、ERK等信號分子的變化情況,確定RhoA在EPM信號作用通路中的位置。 研究結(jié)果顯示在Matrigel培養(yǎng)以及EPM-PT67共培養(yǎng)體系中的WB-F344細胞,細胞形態(tài)均發(fā)生明顯的改變,細胞均收縮并形成管腔樣結(jié)構(gòu),RT-PCR結(jié)果顯示膽管系基因如Yp、Aquaporin、CK19和CX43等的表達量均明顯上調(diào),而且RT-PCR以及免疫熒光的結(jié)果也顯示在WB-F344細胞的膽管分化過程中RhoA的表達量均上調(diào),說明這兩種體外誘導模型均能成功的誘導肝卵圓細胞向膽管細胞分化。我們利用點突變技術成功地構(gòu)建了RhoA基因CA和DN兩種突變體并利用慢病毒載體將這兩種突變體高效轉(zhuǎn)染進WB-F344細胞中。盡管RhoA基因突變并沒有影響WB-F344細胞的細胞周期以及細胞的生長,但是細胞的形態(tài)卻發(fā)生了明顯地變化:轉(zhuǎn)染RhoA DN的WB細胞體積變大,分支增多,核質(zhì)比下降,細胞間隙模糊;而RhoA CA WB細胞則收縮呈圓形,細胞的核質(zhì)比變大,細胞與細胞間有明顯的間隙。透射電鏡檢測顯示轉(zhuǎn)染RhoA CA的WB細胞具有膽管細胞的特異性結(jié)構(gòu):卵圓形的細胞核、核仁彌散、胞漿少、細胞器較少、線粒體形態(tài)較小、細胞間緊密連接較多以及橋粒增多等;而對照細胞則顯示了成熟肝細胞的超微結(jié)構(gòu)特征:圓形的細胞核、核仁明顯、胞漿豐富、細胞器較多、糖原顆粒豐富、較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)偏大以及細胞間無緊密連接等。以上的結(jié)果說明RhoA基因的突變能引發(fā)肝卵圓細胞的形態(tài)學變化并影響其分化決定。我們隨后將CA、DN、con三種WB細胞接種于Matrigel上或者與EPM-PT67細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)即使在沒有Matrigel/EPM作用的情況下RhoA CA WB細胞也能自發(fā)地形成管腔樣結(jié)構(gòu),并且細胞內(nèi)各膽管系基因的表達量明顯上調(diào);EPM無法誘導RhoA DN WB細胞形成管腔樣結(jié)構(gòu),這些結(jié)果說明RhoA在Matrigel和EPM的誘導分化過程中是不可或缺的。在EPM、RhoA的下游信號分子研究中,Y27632抑制RhoA CA以及EPM誘導的WB細胞管腔樣結(jié)構(gòu)的形成;共聚焦顯微鏡下觀察到RhoA CA WB細胞內(nèi)應力纖維束較多,并且應力纖維束沿著細胞拉伸的方向排列,而對照細胞內(nèi)的應力纖維束較少并且呈分散狀分布細胞的邊緣;另一方面雖然三種細胞內(nèi)總ERK蛋白的表達量是一致的,但是RhoA CA WB細胞內(nèi)磷酸化FAK、ERK1/2蛋白的表達量相對于con和RhoA DN WB細胞明顯上調(diào)。由以上結(jié)果得知EPM和RhoA誘導分化的作用信號通路是EPM→αⅴβ1 integrin→RhoA→FAK→ERK1/2→MMP3/CEBPβ→Differetiation以及EPM→αⅴβ1 integrin→RhoA→ROCK→Stress Fibre Formation→Morphogenesis。 綜上所述,我們首先成功構(gòu)建Matrigel培養(yǎng)和EPM-PT67共培養(yǎng)兩種體外誘導分化體系,形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察以及分子水平鑒定都證明WB-F344細胞在這兩種體系下能向膽管細胞分化;其次證明RhoA是Matrigel/EPM誘導的膽管細胞分化過程中不可或缺的重要作用因子,RhoA的缺乏會導致EPM無法誘導WB-F344細胞向膽管細胞分化;最后根據(jù)信號分子表達變化情況提出EPM、RhoA作用的信號通路。我們的研究為體外進行膽管細胞定向誘導分化提供良好的生物學模型,將細胞外基質(zhì)、胞外因子與胞內(nèi)信號分子聯(lián)系起來,對肝前體細胞分化的機制研究具有指導作用,具有廣闊的臨床應用前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2355967