【摘要】： 肝卵圓細(xì)胞是目前公認(rèn)的肝干/祖細(xì)胞之一,具有在體外分化成成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的能力。WB-F344細(xì)胞是從Fischer雄性大鼠肝臟分離出來的卵圓細(xì)胞,常被作為進(jìn)行體外研究肝干/祖細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞或者膽管細(xì)胞分化的模型。Matrigel是一種從小鼠肉瘤中抽提得到的人工合成的可溶性間質(zhì)膜蛋白復(fù)合物,它能夠模擬體內(nèi)間質(zhì)微環(huán)境,促進(jìn)各種管狀結(jié)構(gòu)的形成。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)WB-F344細(xì)胞接種于Matrigel上之后,細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化成為膽管細(xì)胞,細(xì)胞開始收縮形成管腔樣結(jié)構(gòu)并沿著結(jié)構(gòu)拉伸。與此同時發(fā)現(xiàn)膽管系基因如Yp、Aquaporin、CK19等特異性表達(dá)。表皮形態(tài)發(fā)生素epimorphin(EPM)是一個高度保守的間質(zhì)細(xì)胞表面膜蛋白,在哺乳動物中廣泛表達(dá),在腺管狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)EPM也能誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化并且對WB-F344細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)力纖維的排列有很大影響。在Matrigel和EPM誘導(dǎo)的WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化的過程中RhoA的表達(dá)活性均發(fā)生上調(diào)。小G蛋白RhoA是位于細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白,參與控制細(xì)胞的變形、運(yùn)動、粘附及細(xì)胞的分裂、惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等。我們初步的研究結(jié)果也表明RhoA在Matrigel以及EPM誘導(dǎo)的WB-F344細(xì)胞分化過程中發(fā)揮了重要的作用。本課題主要研究細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel、細(xì)胞外因子EPM以及細(xì)胞內(nèi)信號分子RhoA如何有機(jī)結(jié)合誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化。 我們首先成功建立Matrigel誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化的模型,觀察WB-F344細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中的形態(tài)變化、膽管細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化情況以及RhoA的表達(dá)變化情況。與此同時建立EPM-PT67、WB-F344細(xì)胞共培養(yǎng)模型,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將EPM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)PT67細(xì)胞中并通過極限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達(dá)EPM的PT67細(xì)胞。通過絲裂霉素處理EPM-PT67細(xì)胞和PT67細(xì)胞使其停止生長并將其作為滋養(yǎng)層細(xì)胞后,接種WB細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),觀察WB細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、膽管系基因和蛋白的表達(dá)變化情況以及RhoA的表達(dá)情況。在上述工作的基礎(chǔ)上,利用pfu點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了RhoA基因的始終活性突變體CA(Constitutively Active)和始終失活突變體DN(Dominant Negative),經(jīng)測序鑒定正確。之后將基因突變體進(jìn)行慢病毒包裝,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)WB-F344細(xì)胞中,同時利用空慢病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞做對照,觀察RhoA CA WB細(xì)胞、RhoA DN WB細(xì)胞、對照細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化以及膽管系基因的表達(dá)變化情況。電鏡觀察WB-F344細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),尋找膽管細(xì)胞、肝細(xì)胞的特征性超微結(jié)構(gòu),進(jìn)一步判斷RhoA突變后細(xì)胞的分化趨勢。最后進(jìn)行RhoA信號通路的探索和定位,通過加入RhoA下游信號分子ROCK的抑制劑Y27632觀察細(xì)胞形態(tài)的變化等來確定ROCK在該過程中的作用,同時還觀察細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維束的排列,進(jìn)一步明確RhoA-ROCK的作用;與此同時提取RhoA CA、RhoA DN、對照三種WB細(xì)胞的蛋白,利用蛋白電泳技術(shù)觀察EPM信號通路上的FAK、ERK等信號分子的變化情況,確定RhoA在EPM信號作用通路中的位置。 研究結(jié)果顯示在Matrigel培養(yǎng)以及EPM-PT67共培養(yǎng)體系中的WB-F344細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生明顯的改變,細(xì)胞均收縮并形成管腔樣結(jié)構(gòu),RT-PCR結(jié)果顯示膽管系基因如Yp、Aquaporin、CK19和CX43等的表達(dá)量均明顯上調(diào),而且RT-PCR以及免疫熒光的結(jié)果也顯示在WB-F344細(xì)胞的膽管分化過程中RhoA的表達(dá)量均上調(diào),說明這兩種體外誘導(dǎo)模型均能成功的誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化。我們利用點(diǎn)突變技術(shù)成功地構(gòu)建了RhoA基因CA和DN兩種突變體并利用慢病毒載體將這兩種突變體高效轉(zhuǎn)染進(jìn)WB-F344細(xì)胞中。盡管RhoA基因突變并沒有影響WB-F344細(xì)胞的細(xì)胞周期以及細(xì)胞的生長,但是細(xì)胞的形態(tài)卻發(fā)生了明顯地變化:轉(zhuǎn)染RhoA DN的WB細(xì)胞體積變大,分支增多,核質(zhì)比下降,細(xì)胞間隙模糊;而RhoA CA WB細(xì)胞則收縮呈圓形,細(xì)胞的核質(zhì)比變大,細(xì)胞與細(xì)胞間有明顯的間隙。透射電鏡檢測顯示轉(zhuǎn)染RhoA CA的WB細(xì)胞具有膽管細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu):卵圓形的細(xì)胞核、核仁彌散、胞漿少、細(xì)胞器較少、線粒體形態(tài)較小、細(xì)胞間緊密連接較多以及橋粒增多等;而對照細(xì)胞則顯示了成熟肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征:圓形的細(xì)胞核、核仁明顯、胞漿豐富、細(xì)胞器較多、糖原顆粒豐富、較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)偏大以及細(xì)胞間無緊密連接等。以上的結(jié)果說明RhoA基因的突變能引發(fā)肝卵圓細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并影響其分化決定。我們隨后將CA、DN、con三種WB細(xì)胞接種于Matrigel上或者與EPM-PT67細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)即使在沒有Matrigel/EPM作用的情況下RhoA CA WB細(xì)胞也能自發(fā)地形成管腔樣結(jié)構(gòu),并且細(xì)胞內(nèi)各膽管系基因的表達(dá)量明顯上調(diào);EPM無法誘導(dǎo)RhoA DN WB細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu),這些結(jié)果說明RhoA在Matrigel和EPM的誘導(dǎo)分化過程中是不可或缺的。在EPM、RhoA的下游信號分子研究中,Y27632抑制RhoA CA以及EPM誘導(dǎo)的WB細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)的形成;共聚焦顯微鏡下觀察到RhoA CA WB細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維束較多,并且應(yīng)力纖維束沿著細(xì)胞拉伸的方向排列,而對照細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)力纖維束較少并且呈分散狀分布細(xì)胞的邊緣;另一方面雖然三種細(xì)胞內(nèi)總ERK蛋白的表達(dá)量是一致的,但是RhoA CA WB細(xì)胞內(nèi)磷酸化FAK、ERK1/2蛋白的表達(dá)量相對于con和RhoA DN WB細(xì)胞明顯上調(diào)。由以上結(jié)果得知EPM和RhoA誘導(dǎo)分化的作用信號通路是EPM→αⅴβ1 integrin→RhoA→FAK→ERK1/2→MMP3/CEBPβ→Differetiation以及EPM→αⅴβ1 integrin→RhoA→ROCK→Stress Fibre Formation→Morphogenesis。 綜上所述,我們首先成功構(gòu)建Matrigel培養(yǎng)和EPM-PT67共培養(yǎng)兩種體外誘導(dǎo)分化體系,形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察以及分子水平鑒定都證明WB-F344細(xì)胞在這兩種體系下能向膽管細(xì)胞分化;其次證明RhoA是Matrigel/EPM誘導(dǎo)的膽管細(xì)胞分化過程中不可或缺的重要作用因子,RhoA的缺乏會導(dǎo)致EPM無法誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化;最后根據(jù)信號分子表達(dá)變化情況提出EPM、RhoA作用的信號通路。我們的研究為體外進(jìn)行膽管細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化提供良好的生物學(xué)模型,將細(xì)胞外基質(zhì)、胞外因子與胞內(nèi)信號分子聯(lián)系起來,對肝前體細(xì)胞分化的機(jī)制研究具有指導(dǎo)作用,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2355966