【摘要】： 缺血心肌恢復(fù)血流灌注過程中產(chǎn)生的心肌損傷,稱為心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI),常見于冠心病等心血管疾病及體外循環(huán)下行開心直視手術(shù)、心臟移植、冠脈搭橋術(shù)、冠脈溶栓術(shù)及成形術(shù)等心血管疾病治療過程。心肌缺血-再灌注損傷的發(fā)生涉及活性氧產(chǎn)生、鈣超載及能量代謝障礙等機(jī)制,其結(jié)果是導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡。核仁素是真核細(xì)胞核仁中最主要的一種磷酸蛋白質(zhì),具有多種生物學(xué)功能,可調(diào)控核糖體的生物合成與成熟,調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、調(diào)控胚胎發(fā)生、胞質(zhì)分裂、染色質(zhì)復(fù)制與核仁的發(fā)生等過程。作為一種穿梭蛋白和細(xì)胞表面受體,核仁素參與多種物質(zhì)在細(xì)胞核與細(xì)胞漿之間的轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞核功能的細(xì)胞外調(diào)節(jié)。近年研究表明核仁素還在細(xì)胞凋亡發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),在抗腫瘤藥物、紫外線照射等所致的多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),伴有核仁素蛋白的表達(dá)下調(diào)、斷裂和轉(zhuǎn)位改變,而核仁素過表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少,并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)核仁素是通過對(duì)凋亡相關(guān)分子如Bcl-2等mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控而發(fā)揮作用。然而,在心肌缺血-再灌注損傷所致的心肌細(xì)胞凋亡中,核仁素是否發(fā)揮作用及怎樣發(fā)揮作用,目前尚無相關(guān)研究。 本研究首先觀察了大鼠缺血-再灌注損傷心肌中,細(xì)胞凋亡的發(fā)生及核仁素的表達(dá)情況；然后探討了核仁素對(duì)過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響；并進(jìn)一步探討了核仁素影響凋亡發(fā)生的具體機(jī)制。主要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、核仁素在大鼠缺血-再灌注損傷心肌中的表達(dá) (1)大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型的構(gòu)建：結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支30分鐘后再灌注不同時(shí)間,血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)及肌酸激酶-M (creatine kinase, CK-M)明顯增多,心肌組織中活性氧生成增多。這提示心肌缺血-再灌注損傷模型構(gòu)建成功。(2)缺血-再灌注損傷對(duì)大鼠心肌凋亡的影響：心肌缺血30分鐘后再灌注不同時(shí)間,心肌組織中caspase-3活性升高,TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺血-再灌注損傷心肌中細(xì)胞凋亡發(fā)生增多,瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)缺血-再灌注損傷導(dǎo)致DNA-Ladder的形成。以上研究表明,心肌缺血-再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生增多。(3)缺血-再灌注損傷對(duì)大鼠心肌中核仁素表達(dá)的影響：心肌缺血30分鐘后再灌注不同時(shí)間,心肌組織中的核仁素mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯降低,且核仁素蛋白發(fā)生斷裂,即從110kD的全長分子斷裂形成一約80kD的分子。上述結(jié)果表明心肌缺血-再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生增多,核仁素表達(dá)下調(diào)并發(fā)生斷裂。 2、核仁素對(duì)H_2O_2所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 (1)核仁素在大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的時(shí)空表達(dá)模式：將新生大鼠原代心肌細(xì)胞暴露于0.5mmol/L H2O2,發(fā)現(xiàn)核仁素的mRNA及蛋白質(zhì)水平明顯降低、核仁素蛋白發(fā)生斷裂,且在正常情況下大部分核仁素分布在心肌細(xì)胞核,H_2O_2處理則導(dǎo)致核仁素向胞漿移位。(2)核仁素過表達(dá)對(duì)H_2O_2所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：應(yīng)用核仁素真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)核仁素過表達(dá)能明顯抑制H_2O_2所致的心肌細(xì)胞caspase-3活性升高及細(xì)胞凋亡發(fā)生。(3)核仁素低表達(dá)對(duì)H_2O_2所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制核仁素的表達(dá),則發(fā)現(xiàn)核仁素低表達(dá)能進(jìn)一步升高H_2O_2所致的的心肌細(xì)胞caspase-3活性及凋亡發(fā)生。以上結(jié)果表明,在H_2O_2所致大鼠心肌細(xì)胞損傷中,核仁素表達(dá)下調(diào)并發(fā)生斷裂,核仁素對(duì)H_2O_2所致的大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。 3、核仁素抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究 (1)核仁素不同結(jié)構(gòu)域?qū)_2O_2所致的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響：由于在核仁素的氨基端分布有其酶解位點(diǎn),我們推測(cè)氧化應(yīng)激損傷時(shí)形成的80kD核仁素分子是切除了氨基端的核仁素片段,因而我們選用了核仁素氨基端(AA1-309)和核仁素羧基端(AA310-713)兩個(gè)突變體來探討核仁素抗凋亡的可能機(jī)制。將核仁素不同結(jié)構(gòu)域的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)單純轉(zhuǎn)染對(duì)caspase-3活性及細(xì)胞凋亡發(fā)生率無明顯影響；H_2O_2處理后,caspase-3活性及細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯升高,轉(zhuǎn)染核仁素氨基端片段(AA1-309)后caspase-3活性低于轉(zhuǎn)染空載體心肌細(xì)胞組,而轉(zhuǎn)染核仁素羧基端片段(AA310-713)后,心肌細(xì)胞caspase-3活性及凋亡發(fā)生率則明顯高于轉(zhuǎn)染空載體心肌細(xì)胞組。這提示核仁素氨基端(AA1-309)具有部分抗凋亡作用,而核仁素羧基端(AA310-713)則具有促凋亡作用。 (2)核仁素及其不同結(jié)構(gòu)域?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響： 將核仁素RNA干擾片段、核仁素全長或其不同結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2在核仁素過表達(dá)心肌細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào),在RNA干擾所致核仁素低表達(dá)的心肌細(xì)胞中明顯下調(diào),但在核仁素氨基端片段(AA1-309)或羧基端片段(AA310-713)過表達(dá)細(xì)胞中,Bcl-2表達(dá)水平與對(duì)照組細(xì)胞沒有明顯差異。而促凋亡基因Bax則在核仁素過表達(dá)心肌細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào),在核仁素低表達(dá)心肌細(xì)胞中明顯上調(diào)；Bax在核仁素氨基端片段(AA1-309)過表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)無明顯改變,而在核仁素羧基端片段(AA310-713)過表達(dá)細(xì)胞中,Bax表達(dá)增高。上述結(jié)果提示核仁素可促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)并抑制Bax的表達(dá),而核仁素羧基端(AA310-713)則促進(jìn)Bax的表達(dá)。 H_2O_2處理后,心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)下調(diào),核仁素過表達(dá)可抑制H_2O_2所致的Bcl-2表達(dá)下調(diào),核仁素RNA干擾可促進(jìn)H_2O_2所致的Bcl-2表達(dá)下調(diào),但核仁素氨基端片段(AA1-309)或羧基端片段(AA310-713)過表達(dá)對(duì)H_2O_2所致的Bcl-2表達(dá)下調(diào)沒有明顯影響；與此相反,H_2O_2處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞的Bax表達(dá)上調(diào),核仁素過表達(dá)可抑制H_2O_2所致的Bax表達(dá)上調(diào),核仁素RNA干擾或核仁素羧基端片段(AA310-713)過表達(dá)可促進(jìn)H_2O_2所致的Bax表達(dá)上調(diào),但核仁素氨基端片段(AA1-309)過表達(dá)對(duì)H_2O_2所致的Bax表達(dá)上調(diào)沒有明顯影響。以上結(jié)果說明在H_2O_2所致的大鼠心肌細(xì)胞損傷中,核仁素通過增加Bcl-2表達(dá)、減少Bax表達(dá)而抑制心肌細(xì)胞凋亡；核仁素羧基端(AA310-713)則通過增加Bax表達(dá)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。 (3)核仁素及其不同結(jié)構(gòu)域?qū)Φ蛲鱿嚓P(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA穩(wěn)定性的影響： 收集放射菌素D處理后的不同心肌細(xì)胞組,用real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA水平,發(fā)現(xiàn)正常情況下核仁素過表達(dá)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性沒有明顯影響,核仁素低表達(dá)則導(dǎo)致心肌細(xì)胞的Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性降低；經(jīng)H_2O_2處理后,大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2mRNA穩(wěn)定性降低,但核仁素過表達(dá)能抑制H_2O_2所致的Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性下降,核仁素氨基端片段(AA1-309)過表達(dá)則對(duì)H_2O_2所致的Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性的下降沒有明顯影響；上述結(jié)果提示核仁素通過增加Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性,使Bcl-2表達(dá)增多而抑制氧化應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞凋亡。 而核仁素過表達(dá)或低表達(dá)以及核仁素氨基端片段(AA1-309)過表達(dá),對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的Bax mRNA穩(wěn)定性沒有明顯影響；但核仁素羧基端片段(AA310-713)過表達(dá)則明顯增加了Bax mRNA的穩(wěn)定性；經(jīng)H_2O_2處理后,大鼠心肌細(xì)胞中Bax mRNA穩(wěn)定性增高,核仁素過表達(dá)則明顯抑制了H_2O_2所致的Bax mRNA穩(wěn)定性增高。以上結(jié)果表明在H_2O_2所致的大鼠心肌細(xì)胞損傷中,核仁素通過降低BaxmRNA穩(wěn)定性,使Bax表達(dá)減少而發(fā)揮抗凋亡的作用；核仁素羧基端(AA310-713)則通過增加Bax mRNA的穩(wěn)定性,使Bax表達(dá)增多而發(fā)揮促凋亡作用。(4)核仁素與凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax mRNA的相互作用：抽提正�；虮┞队贖_2O_2的大鼠心肌細(xì)胞裂解液,應(yīng)用核仁素抗體進(jìn)行免疫沉淀后,對(duì)沉淀物中的mRNA分子進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果表明,在正常大鼠心肌細(xì)胞中,核仁素可與Bcl-2 mRNA結(jié)合,心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí),核仁素與Bcl-2 mRNA結(jié)合減少；平行的Westernblot結(jié)果顯示在正常情況下,主要為110kD的核仁素全長分子,H_2O_2處理后,110kD核仁素明顯減少,形成大量的80kD斷裂片段；以上結(jié)果提示核仁素可能是通過全長蛋白質(zhì)分子與Bcl-2 mRNA結(jié)合而增加其穩(wěn)定性。 與此相反,在正常大鼠心肌細(xì)胞中核仁素與Bax mRNA結(jié)合很少,心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí),核仁素與Bax mRNA結(jié)合增多；結(jié)合上述平行的Western blot結(jié)果,我們推論,與Bax mRNA結(jié)合的核仁素主要是80kD的片段。正常狀態(tài)下,80kD的核仁素片段較少,氧化應(yīng)激損傷時(shí),核仁素80kD片段增多。該片段可能與Bax mRNA結(jié)合而增加后者的穩(wěn)定性。 綜上所述,核仁素是一重要抗凋亡蛋白,在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用。在缺血-再灌注損傷大鼠心肌及氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞中,核仁素表達(dá)下調(diào)且核仁素蛋白發(fā)生斷裂,這可能是心肌缺血-再灌注損傷及氧化應(yīng)激損傷發(fā)生的重要機(jī)制。在正常情況下核仁素大部分位于心肌細(xì)胞胞核,氧化應(yīng)激損傷時(shí)核仁素向胞漿移位。在正常大鼠心肌細(xì)胞中,核仁素可與Bcl-2 mRNA、Bax mRNA結(jié)合；細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí),核仁素與Bcl-2 mRNA結(jié)合減少、與Bax mRNA結(jié)合增多。氧化應(yīng)激損傷時(shí),核仁素全長蛋白分子通過與Bcl-2 mRNA結(jié)合增加其穩(wěn)定性、與Bax mRNA結(jié)合降低Bax mRNA穩(wěn)定性,從而增加Bcl-2蛋白表達(dá)、減少Bax蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用；核仁素羧基端結(jié)構(gòu)域(AA310-713)則通過增加Bax mRNA穩(wěn)定性使Bax表達(dá)增多而發(fā)揮促凋亡作用。心肌缺血-再灌注損傷及氧化應(yīng)激損傷可能通過減少110kD的核仁素全長蛋白質(zhì)分子與Bcl-2mRNA結(jié)合,并增加80kD片段與Bax mRNA結(jié)合,使得Bcl-2 mRNA穩(wěn)定性降低、Bax mRNA穩(wěn)定性升高,從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2353688