【摘要】： 目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stemcell,BMSCs)具有多向分化潛能。課題組已有實(shí)驗(yàn)表明在加入EGF、IGF-1等生長因子的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下BMSCs能表達(dá)CK,向上皮分化。但BMSCs何時(shí)表達(dá)EGF-R和IGF-1-R以及該受體與細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬測定BMSCs EGF-R和IGF-1-R的表達(dá)時(shí)間;在加入EGF或IGF-1誘導(dǎo)后BMSCs表達(dá)EGF-R、IGF-1-R和CK的變化;以及加入受體阻斷劑后培養(yǎng)的BMSCs是否還能分化為上皮細(xì)胞。擬通過本實(shí)驗(yàn)研究EGF、IGF-1誘導(dǎo)BMSCs分化的機(jī)制,為BMSCs在細(xì)胞移植治療以及組織工程研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法。 第一部分胎兒BMSCs表達(dá)EGF受體和IGF受體及體外誘導(dǎo)分化 1.收集3～5個(gè)月胎齡引產(chǎn)胎兒四肢骨骨髓,分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得BMSCs。比較11～13周的標(biāo)本和20～24周標(biāo)本獲得的BMSCs的生長特點(diǎn)。結(jié)果:13周以內(nèi)標(biāo)本獲得的細(xì)胞擴(kuò)增到P4時(shí),數(shù)量多于20～24周標(biāo)本;首次傳代時(shí)間早,衰老出現(xiàn)時(shí)間晚。 2.檢測BMSCs EGR-R和IGF-1R出現(xiàn)時(shí)間。從P3開始,用免疫組織化學(xué)染色法每天檢測EGF-R、IGF-1-R的表達(dá)。結(jié)果顯示:EGF-R首次表達(dá)為P4第4d～P5第3d;IGF-1-R首次表達(dá)為P5第2d～P6第2d。 3.分別用EGF 30ng/mL,IGF-1 50 ng/mL,EGF 30 ng/mL+IGF-1 50ng/mL誘導(dǎo)P3-BMSCs,設(shè)立無生長因子對照組,檢測EGF-R、IGF-1-R和CK的表達(dá)。結(jié)果:EGF和IGF-1誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)EGF-R和IGF-1-R較對照組提前2～4天;CK表達(dá)最早出現(xiàn)在P4誘導(dǎo)后2天,對照組P6第4d出現(xiàn)微弱的CK表達(dá)。 4用抗EGF-R抗體2mg/mL或抗IGF-1-R抗體1.5mg/mL孵育P5-BMSCs 4h后,分別加入含EGF 30ng/mL、IGF-1 50ng/mL的培養(yǎng)基培養(yǎng),同時(shí)另設(shè)4個(gè)對照組:EGF 30ng/mL,IGF-1 50ng/mL,EGF30ng/M1+IGF-1 50ng/mL和空白對照組。檢測EGF-R、IGF-1-R和CK的表達(dá)。結(jié)果:EGF-R和IGF-1-R阻滯后,第4d可檢測到CK,但CK~+細(xì)胞率和強(qiáng)度均低于加入生長因子誘導(dǎo)組(P＜0.05),接近空白對照組。 第二部分羊膜體外誘導(dǎo)胎兒BMSCs的分化 1.取10例羊膜,用機(jī)械分離和氫氧化銨法去除上皮,制成羊膜結(jié)締組織,光鏡觀察其表面無上皮細(xì)胞。 2.將3.0×10~5個(gè)DAPI標(biāo)記的P4-BMSCs種植于羊膜上,分別用EGF 30ng/mL,IGF-1 50ng/mL,EGF 30 ng/mL+IGF-1 50 ng/mL聯(lián)合誘導(dǎo),同時(shí)設(shè)無生長因子的羊膜對照組和生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片對照組。各組誘導(dǎo)24～28d后,經(jīng)免疫熒光染色后,CLSM下見羊膜鋪片和切片上有DAPI藍(lán)色熒光標(biāo)記核,同時(shí)胞質(zhì)中有CK綠色熒光的細(xì)胞,表明BMSCs己分化為上皮細(xì)胞。 3.誘導(dǎo)培養(yǎng)第10d,各組BMSCs表達(dá)CK細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:單用羊膜或者羊膜浸提液誘導(dǎo)BMSCs分化為上皮的能力強(qiáng)于對照組,P＜0.05;羊膜與EGF、IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)作用強(qiáng)于單用羊膜組,P＜0.05;終濃度30ng/mL EGF的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于50ng/mL IGF-1,P＜0.05。 4.TEM下見羊膜上種植的BMSCs與結(jié)締組織見未見基膜形成,細(xì)胞問未見細(xì)胞連接。 全文結(jié)論 1.13周以內(nèi)標(biāo)本獲得的骨髓細(xì)胞首次傳代時(shí)間早,衰老出現(xiàn)時(shí)間晚;擴(kuò)增到P4時(shí),BMSCs數(shù)量多于20～24周標(biāo)本。 2.P4-BMSCs開始表達(dá)EGF-R,P5-BMSCs開始表達(dá)IGF-1-R。提示此時(shí)是施加EGF、IGF-1等生長因子的合適時(shí)間。 3.EGF和IGF-1誘導(dǎo)后,EGF-R和IGF-1-R表達(dá)CK的時(shí)間早于對照組。表明EGF和IGF-1可促進(jìn)BMSCs表達(dá)EGF-R和IGF-1-R,以及BMSCs向上皮細(xì)胞分化。 4.P3-BMSCs的EGF-R和IGF-1-R阻滯后,其向上皮細(xì)胞分化的時(shí)間和數(shù)量均低于對照組,證明EGF-R和IGF-1-R可能參與了BMSCs向上皮細(xì)胞分化的調(diào)控。 5.BMSCs能在去上皮羊膜上生長,并分化為能表達(dá)CK的上皮細(xì)胞。去上皮羊膜,外源性EGF和IGF-1,以及羊膜結(jié)締組織浸提液在體外都能誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化,以羊膜與外源性EGF和IGF-1聯(lián)合誘導(dǎo)作用最強(qiáng),EGF的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于IGF-1。 6.BMSCs在羊膜上培養(yǎng)28d,可生長呈復(fù)層,并表達(dá)上皮細(xì)胞的標(biāo)記物-CK,但電鏡下BMSCs與羊膜結(jié)締組織間未見基膜形成,細(xì)胞間亦未見細(xì)胞連接�？赡芑ぁ⒓�(xì)胞連接的形成需要更長的時(shí)間,或者更適宜其分化成熟的培養(yǎng)條件。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2353015