【摘要】： 表皮干細(xì)胞是皮膚組織特異性干細(xì)胞,具有強(qiáng)大增殖潛能和自我更新能力,是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復(fù)、改建的關(guān)鍵性源泉,有望成為皮膚組織工程理想的種子細(xì)胞。.了解表皮干細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制是其應(yīng)用的重要前提和理論基礎(chǔ)。國內(nèi)外現(xiàn)有研究主要集中在干細(xì)胞壁龕、整合素家族、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、c-Myc和p63、p16基因的表達(dá)等途徑上,且已取得一定進(jìn)展。近期研究發(fā)現(xiàn),表皮干細(xì)胞離體后其增殖性能與在體有很大差異,即很容易失去其干細(xì)胞特性,體外復(fù)制較為困難,限制了研究的進(jìn)一步深入。目前已知端粒酶活性的喪失及其增殖相關(guān)基因表達(dá)的改變是造成多種成體干細(xì)胞體外復(fù)制和擴(kuò)增受限的主要原因。但造成表皮干細(xì)胞這種差異的原因是否也是如此,目前尚不十分清楚。 端粒酶是一種能延長端粒末端并保持端粒長度的核糖蛋白酶,它能以自身RNA為模板合成端粒DNA并加到染色體末端,補(bǔ)充染色體復(fù)制時丟失的端粒DNA以使端粒延長,從而延長細(xì)胞壽命甚至使其永生化。人端粒酶由一個互補(bǔ)于端粒DNA的RNA亞基(hTR)和具有逆轉(zhuǎn)錄活性的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)及其它相關(guān)蛋白(TPI)組成。其中人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄是決定端粒酶活性的主要限速步驟。 在人體,端粒酶活性存在于干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、部分有再生能力的體細(xì)胞及絕大多數(shù)惡性腫瘤組織中。它的高活性表達(dá)是腫瘤細(xì)胞惡性增殖的一項(xiàng)重要條件,但其適量表達(dá)又具有延長細(xì)胞壽命的作用。隨著干細(xì)胞分化的進(jìn)行,端粒酶活性也隨之降低,至終末分化細(xì)胞已無法測到端粒酶。上調(diào)和維持干細(xì)胞的端粒酶活性,對提高干細(xì)胞體外復(fù)制和擴(kuò)增能力及揭示干細(xì)胞衰老機(jī)制都將具有重要意義。至今已有不少文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用hTERT基因轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、臍血間質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞來延長細(xì)胞增殖壽命的成功嘗試,初步結(jié)果均表明顯著延長了細(xì)胞生命周期,并保持正常表型且沒有惡性轉(zhuǎn)化傾向。皮膚發(fā)育生物學(xué)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),在富含表皮干細(xì)胞的表皮基底層和生長期毛囊中均有端粒酶活性表達(dá),提示端粒酶活性表達(dá)很可能與表皮干細(xì)胞增殖分化機(jī)制之間也存在著重要的內(nèi)在聯(lián)系。目前對體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)特征及其與表皮干細(xì)胞增殖分化的關(guān)系仍缺乏了解。 基于此,本課題采用表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法,觀察hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)特征,探討其對體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用及意義；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法,將構(gòu)建的攜人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞,觀察hTERT mRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)、端粒酶活性和細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,為其在皮膚組織工程中的應(yīng)用提供新思路和理論依據(jù)。第一部分人表皮干細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá) 目的：觀察體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性的表達(dá)特征,探討其對表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用及意義。 方法：取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的妊娠24～26周齡胎兒背部皮膚標(biāo)本,由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供,均得到產(chǎn)婦或家屬知情同意,實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸聯(lián)合消化法分離表皮、Ⅳ型膠原快速粘附法純化人表皮干細(xì)胞,以含表皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基組成的人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,計(jì)算其克隆形成率,測定細(xì)胞周期,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行β1整合素、K19、p63和hTERT單抗檢測。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)分別檢測人表皮干細(xì)胞hTERT mRNA及其蛋白的表達(dá),端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(TRAP)-ELISA檢測端粒酶活性。 結(jié)果：分離培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞呈克隆樣生長,其克隆形成率明顯高于角質(zhì)細(xì)胞對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),82.64%的表皮干細(xì)胞處于G0/G1期；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,人表皮干細(xì)胞β1整合素、K19、p63和hTERT表達(dá)均陽性；RT-PCR和Western blot檢測人表皮干細(xì)胞hTERT mRNA及其蛋白表達(dá)弱陽性；TRAP-ELISA檢測人表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)弱陽性。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶聯(lián)合乙二胺四乙酸消化法分離表皮、Ⅳ型膠原快速黏附法純化培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞呈克隆樣生長,大部分細(xì)胞處于G0/G1期。表明本培養(yǎng)體系分離培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞具有干細(xì)胞生物學(xué)特性。 2、體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞hTERT mRNA及其蛋白表達(dá)和端粒酶活性弱陽性,提示人表皮干細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)與調(diào)控對維持其增殖和自我更新能力可能具有重要意義。第二部分hTERT基因轉(zhuǎn)染人表皮干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 目的：將攜人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞,觀察hTERT mRNA及其蛋白的表達(dá)、端粒酶活性和細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,為其在皮膚組織工程中的應(yīng)用提供新思路和理論依據(jù)。 方法：構(gòu)建與鑒定攜人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞,G418篩選法進(jìn)行抗性克隆篩選。RT-PCR和Western blot分別檢測人表皮干細(xì)胞hTERT mRNA及其蛋白表達(dá),TRAP-ELISA檢測端粒酶活性,倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,計(jì)算其克隆形成率,MTT法測定生長曲線,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期,并行染色體核型分析。 結(jié)果：構(gòu)建擴(kuò)增重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hTERT,經(jīng)酶切的片段與理論預(yù)期長度相符,并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞,24h在熒光顯微鏡488nm波長處可見到EGFP陽性表達(dá)細(xì)胞,整個細(xì)胞均呈綠色。經(jīng)G418篩選得到陽性克隆。轉(zhuǎn)入hTERT基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞hTERT mRNA及其蛋白表達(dá)和端粒酶活性均為陽性,表達(dá)水平強(qiáng)于空載體組和非轉(zhuǎn)染組表皮干細(xì)胞(P0.05),空載體組和非轉(zhuǎn)染組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變,呈克隆樣生長,其克隆形成率高于空載體組和非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(P0.05)；生長曲線顯示,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較空載體組和非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖迅速,生長活躍；細(xì)胞周期分析顯示,轉(zhuǎn)染P5代表皮干細(xì)胞仍84.60%處于G0/G1期；染色體核型分析,細(xì)胞染色體為正常二倍體核型,未發(fā)生畸變。 結(jié)論： 1、采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法可成功將hTERT-pIRES2-EGFP重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTERT mRNA及其蛋白表達(dá)與端粒酶活性明顯增強(qiáng)。 3、轉(zhuǎn)染hTERT基因的人表皮干細(xì)胞呈克隆樣生長,增殖能力增強(qiáng),生命周期延長,且大部分表皮干細(xì)胞仍處于相對靜止期(G0/G1),維持了干細(xì)胞的特性,染色體核型分析未發(fā)生畸變。提示hTERT基因調(diào)控的人表皮干細(xì)胞可穩(wěn)定培養(yǎng),有望成為細(xì)胞移植和皮膚組織工程理想的種子細(xì)胞。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊仕明,房殿春,楊金亮,羅元輝,魯榮,劉為紋,梁光萍;人hTRT正反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建及初步鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年11期

2 梁光萍,羅向東,陳渝,張方,楊宗城;hTERT基因熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年13期

3 成黨校,黃桂君,錢桂生;新型基因轉(zhuǎn)染陽離子脂質(zhì)體研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).藥學(xué)分冊;2000年05期

4 劉德伍;黃培信;毛遠(yuǎn)桂;陳劍平;藍(lán)蔚;王聯(lián)群;;不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的比較[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年50期

5 李建福,付小兵,盛志勇;人胚胎期表皮干細(xì)胞與汗腺發(fā)生過程關(guān)系的研究[J];中華燒傷雜志;2002年06期

6 李海紅,付小兵,周崗,陳偉,孫同柱;細(xì)胞角蛋白在皮膚中的表達(dá)[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2005年07期

7 衛(wèi)立辛,郭亞軍,閆振林,施軍霞,沈鋒,謝天培,崔貞福,吳孟超;檢測人端粒酶活性的端粒酶TRAP-ELISA法的建立[J];中華腫瘤雜志;1998年04期

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本文編號：2352689