【摘要】： 表皮干細胞是皮膚組織特異性干細胞,具有強大增殖潛能和自我更新能力,是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復、改建的關鍵性源泉,有望成為皮膚組織工程理想的種子細胞。.了解表皮干細胞增殖分化調控機制是其應用的重要前提和理論基礎。國內外現有研究主要集中在干細胞壁龕、整合素家族、Wnt信號轉導通路、Notch信號轉導通路、c-Myc和p63、p16基因的表達等途徑上,且已取得一定進展。近期研究發(fā)現,表皮干細胞離體后其增殖性能與在體有很大差異,即很容易失去其干細胞特性,體外復制較為困難,限制了研究的進一步深入。目前已知端粒酶活性的喪失及其增殖相關基因表達的改變是造成多種成體干細胞體外復制和擴增受限的主要原因。但造成表皮干細胞這種差異的原因是否也是如此,目前尚不十分清楚。 端粒酶是一種能延長端粒末端并保持端粒長度的核糖蛋白酶,它能以自身RNA為模板合成端粒DNA并加到染色體末端,補充染色體復制時丟失的端粒DNA以使端粒延長,從而延長細胞壽命甚至使其永生化。人端粒酶由一個互補于端粒DNA的RNA亞基(hTR)和具有逆轉錄活性的端粒酶逆轉錄酶(hTERT)及其它相關蛋白(TPI)組成。其中人端粒酶逆轉錄酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)基因的表達和轉錄是決定端粒酶活性的主要限速步驟。 在人體,端粒酶活性存在于干細胞、生殖細胞、部分有再生能力的體細胞及絕大多數惡性腫瘤組織中。它的高活性表達是腫瘤細胞惡性增殖的一項重要條件,但其適量表達又具有延長細胞壽命的作用。隨著干細胞分化的進行,端粒酶活性也隨之降低,至終末分化細胞已無法測到端粒酶。上調和維持干細胞的端粒酶活性,對提高干細胞體外復制和擴增能力及揭示干細胞衰老機制都將具有重要意義。至今已有不少文獻報道應用hTERT基因轉染人骨髓間充質干細胞、成纖維細胞、成骨細胞、臍血間質細胞、視網膜色素細胞、內皮細胞等多種細胞來延長細胞增殖壽命的成功嘗試,初步結果均表明顯著延長了細胞生命周期,并保持正常表型且沒有惡性轉化傾向。皮膚發(fā)育生物學現有研究發(fā)現,在富含表皮干細胞的表皮基底層和生長期毛囊中均有端粒酶活性表達,提示端粒酶活性表達很可能與表皮干細胞增殖分化機制之間也存在著重要的內在聯系。目前對體外培養(yǎng)的人表皮干細胞端粒酶活性表達特征及其與表皮干細胞增殖分化的關系仍缺乏了解。 基于此,本課題采用表皮干細胞體外分離培養(yǎng)方法,觀察hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性在人表皮干細胞中的表達特征,探討其對體外培養(yǎng)的人表皮干細胞生物學特性的作用及意義；采用脂質體介導轉染法,將構建的攜人端粒酶逆轉錄酶和增強型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達質粒pIRES2-EGFP-hTERT轉染體外培養(yǎng)的人表皮干細胞,觀察hTERT mRNA轉錄及其蛋白的表達、端粒酶活性和細胞生物學特性的變化,為其在皮膚組織工程中的應用提供新思路和理論依據。第一部分人表皮干細胞體外培養(yǎng)、鑒定與端粒酶逆轉錄酶表達 目的：觀察體外培養(yǎng)的人表皮干細胞hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性的表達特征,探討其對表皮干細胞生物學特性的作用及意義。 方法：取因創(chuàng)傷等原因致意外流產的妊娠24～26周齡胎兒背部皮膚標本,由南昌大學第一附屬醫(yī)院產科提供,均得到產婦或家屬知情同意,實驗經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸聯合消化法分離表皮、Ⅳ型膠原快速粘附法純化人表皮干細胞,以含表皮生長因子、角質細胞無血清培養(yǎng)基組成的人表皮干細胞培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細胞形態(tài)學變化,計算其克隆形成率,測定細胞周期,免疫細胞化學染色法行β1整合素、K19、p63和hTERT單抗檢測。逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質免疫印跡法(Western blot)分別檢測人表皮干細胞hTERT mRNA及其蛋白的表達,端粒重復序列擴增法(TRAP)-ELISA檢測端粒酶活性。 結果：分離培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞呈克隆樣生長,其克隆形成率明顯高于角質細胞對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；細胞周期分析發(fā)現,82.64%的表皮干細胞處于G0/G1期；免疫細胞化學染色顯示,人表皮干細胞β1整合素、K19、p63和hTERT表達均陽性；RT-PCR和Western blot檢測人表皮干細胞hTERT mRNA及其蛋白表達弱陽性；TRAP-ELISA檢測人表皮干細胞端粒酶活性表達弱陽性。 結論： 1、本實驗采用胰蛋白酶聯合乙二胺四乙酸消化法分離表皮、Ⅳ型膠原快速黏附法純化培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞呈克隆樣生長,大部分細胞處于G0/G1期。表明本培養(yǎng)體系分離培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞具有干細胞生物學特性。 2、體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞hTERT mRNA及其蛋白表達和端粒酶活性弱陽性,提示人表皮干細胞端粒酶逆轉錄酶的表達與調控對維持其增殖和自我更新能力可能具有重要意義。第二部分hTERT基因轉染人表皮干細胞的實驗研究 目的：將攜人端粒酶逆轉錄酶和增強型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達質粒pIRES2-EGFP-hTERT轉染體外培養(yǎng)的人表皮干細胞,觀察hTERT mRNA及其蛋白的表達、端粒酶活性和細胞生物學特性的變化,為其在皮膚組織工程中的應用提供新思路和理論依據。 方法：構建與鑒定攜人端粒酶逆轉錄酶和增強型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達質粒pIRES2-EGFP-hTERT,采用脂質體介導轉染法將其導入體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞,G418篩選法進行抗性克隆篩選。RT-PCR和Western blot分別檢測人表皮干細胞hTERT mRNA及其蛋白表達,TRAP-ELISA檢測端粒酶活性,倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細胞形態(tài)學變化,計算其克隆形成率,MTT法測定生長曲線,流式細胞儀測定細胞周期,并行染色體核型分析。 結果：構建擴增重組真核表達質粒pIRES2-EGFP-hTERT,經酶切的片段與理論預期長度相符,并轉染體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞,24h在熒光顯微鏡488nm波長處可見到EGFP陽性表達細胞,整個細胞均呈綠色。經G418篩選得到陽性克隆。轉入hTERT基因的質粒轉染組細胞hTERT mRNA及其蛋白表達和端粒酶活性均為陽性,表達水平強于空載體組和非轉染組表皮干細胞(P0.05),空載體組和非轉染組組間差異無統(tǒng)計學意義；質粒轉染組細胞形態(tài)未發(fā)生改變,呈克隆樣生長,其克隆形成率高于空載體組和非轉染組細胞(P0.05)；生長曲線顯示,質粒轉染組細胞較空載體組和非轉染組細胞增殖迅速,生長活躍；細胞周期分析顯示,轉染P5代表皮干細胞仍84.60%處于G0/G1期；染色體核型分析,細胞染色體為正常二倍體核型,未發(fā)生畸變。 結論： 1、采用脂質體介導轉染法可成功將hTERT-pIRES2-EGFP重組真核表達質粒轉染體外培養(yǎng)的人胎兒表皮干細胞,轉染細胞hTERT mRNA及其蛋白表達與端粒酶活性明顯增強。 3、轉染hTERT基因的人表皮干細胞呈克隆樣生長,增殖能力增強,生命周期延長,且大部分表皮干細胞仍處于相對靜止期(G0/G1),維持了干細胞的特性,染色體核型分析未發(fā)生畸變。提示hTERT基因調控的人表皮干細胞可穩(wěn)定培養(yǎng),有望成為細胞移植和皮膚組織工程理想的種子細胞。
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【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2352689