【摘要】： 丙型肝炎病毒(HCV)是導致輸血相關性和社區(qū)獲得性肝炎的主要病原,感染者中大約70%發(fā)展為慢性肝炎,其中20%-30%進展到肝硬化,所有感染者罹患肝癌的風險增加。目前,唯一可用療法是干擾素(IFN-α)單獨或與利巴韋林聯(lián)合使用,治療費用昂貴,治愈率較低,可能產生嚴重的副作用。因此,發(fā)展一種抗丙型肝炎病毒的疫苗是目前控制HCV感染的有效策略。 研究表明,HCV感染的有效的預防與清除,需要強有力的和持久的T細胞介導的特異性免疫應答。在臨床前研究中,DNA免疫已經成為一種能夠誘導保護性T細胞免疫反應的有效和安全的疫苗研發(fā)策略。然而,在非人靈長類動物實驗和人體試驗中,DNA疫苗的免疫原性遠不及其在小鼠試驗中所表現(xiàn)出的強度。近來有一些提高DNA疫苗免疫原性的策略被應用到動物實驗中,包括采用電轉的方式提高DNA的攝入量和靶蛋白表達,融合表達抗原和功能蛋白以改善抗原特異性遞呈,聯(lián)合應用免疫刺激劑和分子佐劑以提高免疫應答水平等。 HCV實驗性DNA疫苗的研究已有大量報導,并有幾種疫苗進入臨床試驗。但其人群應用的障礙主要為免疫原性不理想。為研發(fā)新型HCV DNA疫苗并探討優(yōu)化其免疫原性的策略,本研究選取文獻報道中已證實的在HCV感染清除中具有重要作用的靶抗原,包括結構蛋白(核殼蛋白C,包膜蛋白E1與E2)與相對保守的非結構蛋白3(NS3),應用復制型(pSCK)或非復制型(pVRC)質粒DNA疫苗載體,分別構建了幾種能夠表達NS3與Core的融合蛋白、E1E2蛋白、NS3及NS3與DEC205融合蛋白的DNA疫苗,瞬時轉染鑒定其表達,采用直接注射或注射結合電轉的方式免疫Balb/C小鼠,對其體液與細胞免疫效果進行研究,從而為研發(fā)新型HCV DNA疫苗并優(yōu)化其免疫原性提供依據。主要研究結果如下： 1.為比較蛋白疫苗與DNA疫苗在小鼠中的免疫應答特點,同時優(yōu)化免疫程序及評價電轉對DNA疫苗免疫原性的影響,我們構建了NS3與Core融合蛋白的HCV DNA疫苗表達質粒,瞬時轉染293T細胞后通過Western blot鑒定其表達,將該DNA疫苗質粒采用肌肉注射和皮內注射兩種方式免疫小鼠,分別結合不同電轉方式(2針陣列式電極電轉或卡鉗式電極電轉)來提高免疫原性；以C44P蛋白疫苗肌肉注射免疫組為對照；通過ELISA和ELISPOT檢驗不同HCV疫苗的體液免疫和細胞免疫應答。結果表明：DNA疫苗免疫各組誘發(fā)的細胞免疫反應均強于蛋白疫苗組,DNA疫苗各組中肌肉注射組結合2針陣列式電極電轉組要強于單獨肌肉注射組,皮內注射結合卡鉗式電極組要強于皮內注射結合2陣陣列式電極組,各質粒注射產生的抗體亞型以lgG1型為主。 2.為比較分析基于復制型載體pSCK與常規(guī)應用的非復制型載體pVRC的HCV DNA疫苗的免疫原性,分別采用表達包膜蛋白的pVRC-JFH1-E1E2、pVRC-HeBei-E1E2、pSCK-HeBei-E1E2質粒免疫小鼠,應用基于HeBei株包膜蛋白序列的特異性肽段或肽庫進行的ELISPOT檢測結果表明：基于復制型載體構建的DNA疫苗誘導產生的特異性IFN-γ高于非復制型載體構建的DNA疫苗,且其中皮內注射結合卡鉗電極組產生的反應最強。以保守的肽段作為檢測抗原進行ELISA分析特異性抗體應答,上述各組誘發(fā)產生的IgG滴度均低于1：50。 3.為進一步評價新型樹突狀細胞靶向的分子佐劑(DEC205單鏈抗體分子)對HCV DNA疫苗免疫原性的增強作用,我們構建了融合表達DEC205單鏈抗體分子與HCV NS3的DNA疫苗質粒pVRC-DEC-NS3,通過瞬時轉染293細胞鑒定其表達,然后采用皮內注射結合卡鉗電極電轉的方式二針快速免疫小鼠,另設一組以同樣方式注射質粒pVRC-DEC和pVRC-NS3的混合物,結果表明：對于pVRC-NS3單獨免疫或者同pVRC-DEC共同免疫,無論是體液免疫方面還是細胞免疫方面應答水平均較低,但是采用NS3和DEC205的融合蛋白表達質粒pVRC-DEC-NS3免疫則免疫原性顯著增強。綜上所述,以HCV結構蛋白Core、E1、E2為靶抗原或者非結構蛋白NS3為靶抗原構建的新型DNA疫苗免疫小鼠,均可誘發(fā)特異性細胞免疫應答；應用電轉技術有助于提高HCV DNA疫苗的免疫原性,使用皮內注射結合卡鉗電極的注射方案誘導產生的細胞免疫反應最強；基于復制型載體構建的DNA疫苗誘導產生的特異性IFN-γ高于非復制型載體構建的DNA疫苗,并可降低疫苗應用劑量；HCV非結構蛋白NS3與DEC205單鏈抗體分子融合表達構成的DNA疫苗(pVRC-DEC-NS3)免疫后誘導的靶抗原特異的體液與細胞免疫應答明顯強于非融合的HCV NS3 DNA疫苗(pVRC-NS3)。上述研究結果為新型HCV DNA疫苗(也包括其他病毒性疾病DNA疫苗)的研發(fā)及優(yōu)化應用提供了重要的科學依據。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 ;丙型肝炎防治指南[J];中華醫(yī)學雜志;2004年09期

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本文編號：2352647