【摘要】： 第一部分： 干擾素-γ與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)協(xié)同作用機(jī)制研究 [目的] 1探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在體外對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用,研究其主要作用機(jī)制。 2探討干擾素—γ(IFN—γ)作用下MSC免疫活性變化情況,闡明IFN—γ與MSC在免疫調(diào)節(jié)中的協(xié)同作用。 [方法] 1采用密度梯度離心法或直接貼壁法從正常成人骨髓中分離擴(kuò)增MSC,取培養(yǎng)后3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。 2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)MSC單獨(dú)培養(yǎng)、MSC與IFN-γ共培養(yǎng)后培養(yǎng)上清液中前列腺素E2(PGE2)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1(TGF-β1)表達(dá)水平,比較IFN-γ作用下MSC分泌可溶性因子水平變化情況；采用抗CD3單克隆抗體(mAb)和抗CD28mAb刺激T淋巴細(xì)胞增殖,在培養(yǎng)體系中加入HGF或TGF-β1等細(xì)胞因子,5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)ELISA試劑盒檢測(cè)上述細(xì)胞因子對(duì)T細(xì)胞增殖的影響。 3提取MSC細(xì)胞RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)方法檢測(cè)MSC細(xì)胞內(nèi)吲哚胺2,3—雙加氧酶(IDO)表達(dá)水平；將MSC與IFN-γ共培養(yǎng)48h后,RT—PCR方法再次檢測(cè)IDO表達(dá)水平,與MSC單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行比較；采用不同濃度IFN-γ與MSC共培養(yǎng),檢測(cè)MSC細(xì)胞內(nèi)IDO表達(dá)水平變化情況；在T細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入犬尿酸(100μM),BrdU試劑盒檢測(cè)T細(xì)胞增殖變化,探討IDO的免疫抑制作用。 4將MSC加入T細(xì)胞培養(yǎng)體系中,BrdU試劑盒檢測(cè)T細(xì)胞增殖水平,驗(yàn)證MSC在體外對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用；在反應(yīng)體系中分別加入IFN—γ及鼠抗人IFN—γmAb,檢測(cè)T細(xì)胞增殖水平變化情況。 [結(jié)果] 1采用密度梯度離心法和直接貼壁法培養(yǎng)獲得的MSC在形態(tài)和增殖速度方面沒(méi)有明顯差異。原代細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)瓶后呈集落樣生長(zhǎng),經(jīng)過(guò)2-3周左右細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合達(dá)80～90%,消化后平均每個(gè)底面積25 cm2的培養(yǎng)瓶可獲得3～4×105細(xì)胞,之后按照1：2或1：3比例進(jìn)行傳代。傳至第3-4代時(shí),可獲得約3～5×106細(xì)胞,供實(shí)驗(yàn)使用或液氮凍存。 2將3份MSC標(biāo)本按1×105細(xì)胞／孔接種于24孔板,每24h留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液。在培養(yǎng)24-48h內(nèi)即可檢測(cè)到PGE2、HGF和TGF—β1三種細(xì)胞因子表達(dá)。并且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),上清液中上述細(xì)胞因子濃度逐漸升高,至培養(yǎng)后144h(6d),三種細(xì)胞因子表達(dá)水平均趨于穩(wěn)定。 設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組中MSC與IFN—γ(100ng／m1)共培養(yǎng),對(duì)照組中MSC單獨(dú)培養(yǎng)。144h后留取兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,實(shí)驗(yàn)組上清液中PGE2濃度為1715.5167±628.5726pg／ml,而對(duì)照組PGE2濃度為1344.5163±709.3583pg／ml,較實(shí)驗(yàn)組明顯降低,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。實(shí)驗(yàn)組上清液中HGF濃度為4031.7733±1496.8027pg／ml,對(duì)照組HGF濃度為2452.4267±1375.3291 pg／ml,較實(shí)驗(yàn)組明顯降低(P=0.011)。實(shí)驗(yàn)組上清液中TGF—β1濃度為1753.5363±413.8059 pg／ml,對(duì)照組TGF—β1濃度為1026.6080±450.5418pg／ml,亦較實(shí)驗(yàn)組明顯降低(P0.001)。 外周血T細(xì)胞在抗CD3mAb和抗CD28mAb的刺激下顯著增殖,加入HGF濃度分別為10ng／ml、20ng／ml和40ng／ml時(shí),T細(xì)胞增殖的抑制率分別為(17.4750±9.8577)%、(27.7183±8.6342)%和(36.6233±11.8959)%,隨著HGF濃度升高,對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用也越強(qiáng)。HGF濃度為40ng／ml時(shí),T細(xì)胞增殖抑制率明顯高于HGF濃度10ng／ml組(P=0.005)。 加入TGF—β1濃度分別為500pg／ml、1000pg／ml和2000pg／ml時(shí),T細(xì)胞增殖的抑制率分別為(13.2163±6.0858)%、(20.6529±7.3306)%和(32.5013±11.2595)%。TGF—β1濃度為2000pg／ml時(shí),T細(xì)胞增殖抑制率明顯高于TGF—β1濃度500pg／ml組(P0.001)和1000pg／ml組(P=0.015)。 3在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入外源性犬尿酸(100μM)后,T細(xì)胞增殖明顯受抑,較陽(yáng)性對(duì)照組明顯減低(P=0.004)。 MSC單獨(dú)培養(yǎng)后提取細(xì)胞總RNA,半定量RT—PCR方法未檢測(cè)到明顯IDOmRNA表達(dá)。將MSC與IFN—γ(100ng／ml)共培養(yǎng)后,IDOmRNA明顯高表達(dá)。此外,在極低濃度IFN—γ(1ng/ml)作用下,即可檢測(cè)到IDOmRNA表達(dá)。 4 MSC顯著抑制抗CD3mAb和抗CD28mAb刺激下的T細(xì)胞增殖,并且隨著MSC細(xì)胞密度增高,對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用也越強(qiáng)。將MSC(2×104細(xì)胞／孔)與不同供者來(lái)源T細(xì)胞(1×105細(xì)胞／孔)共培養(yǎng),T細(xì)胞增殖均顯著受抑(P0.001)。在上述MSC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中加入IFN—γ(100ng/ml),不會(huì)影響MSC對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用(P=0.272)；相反,在反應(yīng)體系中加入鼠抗人IFN—γmAb(5μg/ml)以拮抗IFN—γ的作用,MSC的免疫抑制作用即顯著減弱(P=0.002),T細(xì)胞增殖部分恢復(fù)。 [結(jié)論] 1 MSC組成性表達(dá)PGE2、HGF及TGF-β1等可溶性因子,其表達(dá)水平在體外實(shí)驗(yàn)中均可抑制T淋巴細(xì)胞增殖,此為MSC免疫抑制作用的主要機(jī)制之一。在一定水平IFN-γ作用下,MSC分泌上述三種免疫抑制性細(xì)胞因子水平上調(diào),證實(shí)IFN-γ與MSC在免疫抑制中的協(xié)同作用。 2 IDO通過(guò)降解色氨酸為犬尿酸抑制T淋巴細(xì)胞增殖。MSC單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)不表達(dá)IDO活性,但是在IFN-γ誘導(dǎo)作用下,IDO表達(dá)水平顯著增高,此亦為MSC發(fā)揮免疫抑制作用的主要機(jī)制之一 3骨髓MSC在體外顯著抑制異基因T淋巴細(xì)胞增殖,并且此抑制作用沒(méi)有MHC限制性。外源性IFN-γ不僅不會(huì)削弱MSC的免疫抑制活性,而且同樣具有抑制T細(xì)胞增殖的作用,加入IFN-γmAb后可以逆轉(zhuǎn)MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。 第二部分： 造血干細(xì)胞移植供受者乙型肝炎病毒感染的臨床隨訪(fǎng)研究 [目的] 分析移植前乙型肝炎病毒(HBV)感染的供、受者在異基因造血干細(xì)胞移植(allo—HSCT)后,受者HBV血清學(xué)標(biāo)記變化及對(duì)臨床結(jié)果的影響。 [方法] 對(duì)我院2002年9月至2008年11月間allo—HSCT治療前供、受者合并HBV感染的79例患者進(jìn)行隨訪(fǎng)研究,對(duì)其疾病預(yù)后與轉(zhuǎn)歸、移植后肝功能及HBV血清學(xué)標(biāo)記變化等臨床資料進(jìn)行回顧性分析。 [結(jié)果] 1移植前供、受者HBV感染對(duì)受者預(yù)后無(wú)明顯影響。 2 HBsAgI陽(yáng)性組患者20例,13例(65.0%)出現(xiàn)HBV激活,時(shí)間為移植后1(0.5-10)月,9例(45.0%)并發(fā)乙肝相關(guān)肝炎。 3 HBsAg陰性組患者35例,4例(11.4%)移植后HBsAg轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,即出現(xiàn)乙肝血清學(xué)轉(zhuǎn)換,其中1例伴隨嚴(yán)重慢性移植物抗宿主病(cGVHD). 4 HBsAg陽(yáng)性組患者移植后出現(xiàn)HBV激活及+100d內(nèi)肝功能損害的比例均明顯高于HBsAg陰性組患者(P0.05)。 52例(10.0%)HBsAg陽(yáng)性患者在移植后清除體內(nèi)HBV,其供者乙肝血清學(xué)標(biāo)志均為HBsAb陽(yáng)性。 [結(jié)論] 1供、受者HBV感染不是allo—HSCT禁忌證。 2 HBsAg陽(yáng)性是移植后發(fā)生HBV激活的高危因素,對(duì)于這類(lèi)患者應(yīng)進(jìn)行規(guī)范性拉米夫定預(yù)防性治療。 3 HBcAb／HBeAb陽(yáng)性患者移植后可能出現(xiàn)乙肝血清學(xué)轉(zhuǎn)換,在免疫抑制劑減量過(guò)程中應(yīng)密切監(jiān)測(cè)其乙肝血清學(xué)標(biāo)記變化情況。 4 allo—HSCT可以通過(guò)過(guò)繼免疫治療清除患者體內(nèi)HBV。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Wannee Asavaroengchai;BimalangshuR.Dey;;Role of Interferon-γ in GVHD and GVL[J];Cellular & Molecular Immunology;2005年05期

，

本文編號(hào)：2352435