發(fā)布時間：2018-11-22 13:14

【摘要】： 抗體對于蛋白質(zhì)研究至關(guān)重要,因?yàn)樗鼈兛梢耘c蛋白特異性結(jié)合,從而使研究人員能夠在體外或體內(nèi)對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和功能研究。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的迅猛發(fā)展,迫切需要大量的抗體來滿足高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求。傳統(tǒng)抗體制備方法需要全蛋白抗原或合成肽免疫動物,全蛋白不易得到,純化過程耗時、費(fèi)力,而通過化學(xué)合成法合成抗原肽成本較高,并且還需要與載體蛋白偶聯(lián)后才能用于動物免疫,因此,對于高通量的抗體制備而言,抗原的獲得是其中關(guān)鍵的限速步驟�？乖砦皇钦T導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,因此,本研究將目光投向表位抗原,目的就是建立一種基于B細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)抗體制備新方法,實(shí)現(xiàn)在不需要制備完整蛋白質(zhì)抗原條件下的抗體制備。 本研究的基本策略就是根據(jù)蛋白質(zhì)的一、二級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)信息,選擇蛋白質(zhì)抗原的特異性B細(xì)胞表位,將該B細(xì)胞表位序列展示于T7噬菌體的表面,提取重組的T7噬菌體免疫動物,通過細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體,通過ELISA、Western blot等方法篩選能夠識別全蛋白質(zhì)抗原的抗體。 如何選擇有效的B細(xì)胞表位是能否實(shí)現(xiàn)無完整蛋白質(zhì)抗原條件下抗體制備的關(guān)鍵。對于B細(xì)胞表位的選擇,我們提出了以下的策略:對于已有空間結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)抗原,直接選擇蛋白分子表面的loop區(qū)或無規(guī)卷曲區(qū)域的小肽序列作為候選B細(xì)胞表位;對于缺乏空間結(jié)構(gòu)信息的蛋白質(zhì)抗原,需要根據(jù)蛋白質(zhì)抗原的特點(diǎn)具體分析。若蛋白質(zhì)抗原C末端的序列親水性好,可以選擇C末端的6～10個氨基酸的序列作為候選B細(xì)胞表位,并且最好該序列為該蛋白質(zhì)所特有;也可采用B細(xì)胞表位預(yù)測程序進(jìn)行分析,選擇不同程序預(yù)測的共有B細(xì)胞表位;對于同源性很高的家族蛋白,根據(jù)序列比對結(jié)果選擇差異較大的區(qū)域,并且所選序列應(yīng)該符合B細(xì)胞表位的特征。基于以上原則,本實(shí)驗(yàn)選擇了10個蛋白的14個表位,并對其中的12個表位進(jìn)行了驗(yàn)證。 由于蛋白質(zhì)抗原的B細(xì)胞表位肽分子量小,直接用作免疫原免疫動物很容易被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解,因此,需要與合適的載體偶聯(lián)以增強(qiáng)其免疫原性。本課題中采用T7Select415-1b高拷貝噬菌體載體展示B細(xì)胞表位,該載體能夠在T7噬菌體表面同時展示415個小肽拷貝,所展示小肽的長度可達(dá)到50個氨基酸。我們用T7Select415-1b分別展示了來源于10個蛋白質(zhì)的12個長度為6個、9個或11個氨基酸的表位。用提取的重組噬菌體免疫動物,六周后經(jīng)ELISA檢測,各種重組噬菌體都能誘導(dǎo)針對相應(yīng)B細(xì)胞表位的抗體產(chǎn)生,且特異性良好。用Western blot檢測了其中的4種抗血清,無論是針對蛋白質(zhì)C末端小肽的抗體,還是針對蛋白表面loop區(qū)的抗體,均能識別相應(yīng)B細(xì)胞表位來源的全蛋白分子。由此可見,T7噬菌體-表位肽抗原具有較好的免疫原性,是比較理想的表位抗原,完全可以替代常用的匙孔藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白等小肽偶聯(lián)載體蛋白。 本課題還嘗試多表位抗原混合免疫策略。將來源于五種蛋白質(zhì)抗原的五種不同的表位抗原混合免疫同一只兔子,八周后采用ELISA檢測發(fā)現(xiàn),兔子同時產(chǎn)生了針對五種不同表位的抗體,但效價存在差別。隨著免疫次數(shù)的增加,僅有一種針對MAGE A10表位的抗體效價仍保持較高水平,針對其它表位的抗體效價均大幅降低,這表明多表位混合免疫可能存在優(yōu)勢表位問題,利用混合免疫法同時制備針對多表位的抗體,需把握好免疫次數(shù)和取血的時間點(diǎn),才能獲得理想的抗血清。為了將針對某一表位的抗體從多種抗體的混合物中分離出來,制備了針對其中兩個表位的親和柱,讓多種抗體的混合物依次串聯(lián)通過親和柱,之后,逐一洗脫,得到了兩種特異性良好的多克隆抗體,為批量化制備單特異性多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證基于B細(xì)胞表位的替代抗原策略制備蛋白質(zhì)抗體的可行性,本課題還利用該策略制備了針對三種蛋白質(zhì)抗原的特異性單克隆抗體。從HPO、Pif1α和Pif1β三種蛋白質(zhì)抗原中各選取了一個B細(xì)胞表位,制備了T7噬菌體-表位肽抗原,通過動物免疫、細(xì)胞融合和篩選,最終得到了三株單克隆抗體,它們分別能夠特異性識別相應(yīng)的B細(xì)胞表位。針對Pif1βB細(xì)胞表位的單克隆抗體由于沒有全蛋白抗原,沒有驗(yàn)證其是否能夠識別Pif1β全蛋白。但針對HPO和Pif1α的B細(xì)胞表位的單克隆抗體經(jīng)Western blot驗(yàn)證,分別能夠識別HPO和Pif1α全蛋白抗原,并且針對Pif1α的單克隆抗體還可用于Pif1α在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位,其定位結(jié)果與文獻(xiàn)報道的Pif1α的核定位一致。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明,基于B胞表位的蛋白質(zhì)抗體制備技術(shù)是完全可行的。 總之,通過本課題的研究建立了基于B細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)抗體制備方法,實(shí)現(xiàn)了無需完整抗原的蛋白質(zhì)抗體的制備。該技術(shù)方法可以實(shí)現(xiàn)基于B細(xì)胞表位的替代抗原的快速制備,可滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高通量抗體制備對抗原的大量需求�；贐細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)抗體制備方法還可用于制備特定功能的抗體,如中和性抗體、抑制性或激動性抗體,這對于開發(fā)具有治療作用的抗體和疫苗具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：2349473