【摘要】：幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種專寄生于人胃黏膜的革蘭陰性微需氧菌,世界上至少有50%人口感染H. pylori。許多研究表明,H. pylori感染后可導(dǎo)致胃炎和消化性潰瘍等疾病,而且是胃癌、初級B淋巴瘤、硬化性膽管炎等疾病的重要因素。H. pylori的感染和發(fā)病涉及多個毒力因子。H.pylori接觸胃粘膜上皮后可誘導(dǎo)表達(dá)一種毒力相關(guān)因子----粘膜接觸誘導(dǎo)因子,是獨立于cagA和vacA之外的一個重要毒力相關(guān)基因,由iceA (induced by contact with epithelium, iceA)基因編碼,包括iceA1、iceA2兩種等位基因。該基因可能通過調(diào)控相關(guān)毒素基因的表達(dá)等機(jī)制,參與Hp的致病作用。有研究發(fā)現(xiàn),iceA基因與消化性潰瘍及IL-8的黏膜濃度增高顯著相關(guān),而IL—8在H. pylori所致相關(guān)性炎癥及疾病中發(fā)揮著重要作用。雖然國內(nèi)外研究人員針對iceA基因與H. pylori所致臨床疾病的相關(guān)性進(jìn)行了大量研究,認(rèn)為iceA基因(包括iceA1和iceA2基因)是慢性胃炎和十二指腸潰瘍特異性相關(guān)基因,是一種與炎癥和免疫損傷有關(guān)的毒力因子。但是iceA基因生物學(xué)功能及其致病機(jī)制仍不十分清楚。 研究首先利用鄭州市慢性萎縮性胃炎患者幽門螺桿菌臨床分離株MEL-H.pylori 27,對iceA基因進(jìn)行了克隆和序列分子特征分析；又根據(jù)同源重組原理,利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行了Hp27 iceA基因的插入失活突變,構(gòu)建了iceA基因的Hp27突變株；然后進(jìn)一步比較遺傳背景相同的野生株和構(gòu)建的Hp27 iceA基因突變株的重要特性,包括菌株的尿素酶活性、與細(xì)胞體外共培養(yǎng)時對胃粘膜上皮細(xì)胞的形態(tài)特征、細(xì)胞周期、增殖、凋亡等特性的影響；比較野生株和突變株對細(xì)胞的黏附性以及誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL—8能力等炎癥相關(guān)因素。為闡明iceA基因的功能及參與Hp致病的分子機(jī)制奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。 方法 1幽門螺桿菌菌株的培養(yǎng)及基因組DNA的制備 將臨床分離株MEL-Hp27(Hp27)接種于布氏平板上,37℃微需氧條件下培養(yǎng)。3d后收獲細(xì)菌,提取基因組DNA。 2 Hp27 iceA基因的克隆 2.1引物設(shè)計及PCR擴(kuò)增 參照GenBank公布的H.pylori菌株的iceA基因及其上下游核苷酸序列設(shè)計引物,用于擴(kuò)增包括iceA基因在內(nèi)的基因序列,擴(kuò)增片段長度約790 bp。 2.2 iceA基因克隆與測序 PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選含重組質(zhì)粒的陽性克隆,測序并分析。 2.3基因序列特征分析 從GenBank上檢索H.pylori菌株的iceA基因的同源基因序列,用Clustal W軟件對檢索到的基因序列進(jìn)行多重序列比較,應(yīng)用MEGA4.0等軟件對基因及相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行同源比較,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行分析。 3 iceA基因打靶載體的構(gòu)建 3.1將重組質(zhì)粒pMD19-T-iceA及質(zhì)粒pBluescript SKⅡ(一)分別酶切并連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBS-iceA。 3.2將重組質(zhì)粒pBS-iceA和卡那霉素抗性基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切并連接,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)記的突變打靶載體pBS-iceA-km。 4 iceA基因突變株的構(gòu)建與鑒定 采用電穿孔方法將打靶載體pBS-iceA-km電轉(zhuǎn)化入受體菌株野生型Hp27中,在普通布氏平板上培養(yǎng)48h,然后轉(zhuǎn)涂于含卡那霉素布氏平板上繼續(xù)培養(yǎng)3-5d,篩選出iceA基因突變株,經(jīng)PCR及測序進(jìn)行鑒定。 5野生株和iceA基因突變株特性比較 5.1采用尿素酶活性診斷試劑,檢測和比較野生株Hp27和Hp27 iceA插入失活突變株的尿素酶活性差異。 5.2將細(xì)菌與SGC7901細(xì)胞共同培養(yǎng)一定時間,觀察和比較細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 5.3采用MTT比色法,檢測野生株Hp27和Hp27 iceA插入失活突變株對SGC7901細(xì)胞增殖活性的影響并分析比較。 5.4流式細(xì)胞儀檢測野生株、突變株與SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間后細(xì)胞周期的改變并分析比較。 5.5流式細(xì)胞儀檢測野生株、突變株與SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間后細(xì)胞的凋亡率并分析比較。 6 iceA基因的炎癥相關(guān)因素研究 6.1 Hp誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-8的分析 H. pylori27野生株與突變株分別與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間,誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-8。收集培養(yǎng)上清液,用ELISA試劑盒定量檢測IL-8的濃度并分析。 6.2 H. pylori 27野生株與突變株對胃粘膜上皮細(xì)胞的黏附作用分析 野生株與突變株分別與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時間,用免疫學(xué)方法處理,在熒光倒置顯微鏡下觀察,流式細(xì)胞儀檢測并分析其粘附率。 7統(tǒng)計學(xué)分析處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件分析各指標(biāo)數(shù)據(jù),計量資料以x±S表示,兩組之間的比較采用t檢驗；多組之間的比較,根據(jù)資料特點分別采用單因素方差分析或重復(fù)測量的方差分析；兩兩比較采用最小顯著差法(LSD),檢驗水準(zhǔn)取a=0.05。 結(jié)果 1幽門螺桿菌分離株MEL-Hp27 iceA基因克隆及分析 成功克隆幽門螺桿菌Hp27菌株iceA基因序列,擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為790 bp；重組質(zhì)粒pMD19-T-iceA單酶切產(chǎn)生3820 bp片段,雙酶切產(chǎn)生3000 bp和820 bp的2個片段；Hp27 iceA基因與大多數(shù)美國來源菌株同源性較高,均大于85%,與日本、印度等地區(qū)來源菌株同源性小于70%；Hp27 iceA基因一10區(qū)(TATA)位于起始密碼子ATG上游的17bp處,起始密碼子上游—7nt處有一個SD序列,起始密碼子和上游cysE基因之間有兩個8bp的串聯(lián)可重復(fù)序列,其它地區(qū)分離菌株與Hp27 iceA基因特征有差異。 2 MEL-Hp27 iceA基因突變株的構(gòu)建 采用基因重組的方法將卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中,構(gòu)建了突變打靶載體pBS-iceA-km;通過電穿孔轉(zhuǎn)化方法將突變載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入野生株,篩選出iceA基因突變株。用iceA基因兩端序列設(shè)計引物分別擴(kuò)增突變株和野生株的基因組DNA,結(jié)果突變株的擴(kuò)增片段長度比野生株長約800bp,且突變株能擴(kuò)增出卡那霉素抗性基因片段,野生株則不能。擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果證明卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中。 3野生株和iceA基因突變株尿素酶活性比較 將構(gòu)建的突變株和野生株分別與尿素酶試劑作用,立即引起明顯的顏色改變,野生株25min完全分解尿素酶試劑達(dá)到其最大吸光度值,且在此之前其吸光度值均高于突變株組。突變株組在50 min達(dá)到其最大吸光度值,且在作用25min后的吸光度值均高于野生株組,但兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 4 iceA基因?qū)GC7901細(xì)胞生長的影響 H.pylori突變株組和野生株組引起相似的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞拉伸,出現(xiàn)蜂鳥樣改變；細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)12h和18h,與對照組相比細(xì)胞活力輕度增加。共培養(yǎng)24h后,與對照組相比細(xì)胞活力則下降。在細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)12h、18h、24h,野生株組和突變株組細(xì)胞增殖活性與空白組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);培養(yǎng)30h和36h各組細(xì)胞的增殖活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中,培養(yǎng)30h時突變株組的細(xì)胞增殖活性高于野生株組(P0.05)；與對照組相比,野生株對細(xì)胞周期的影響主要表現(xiàn)為G2期的阻滯；而突變株對細(xì)胞周期的影響主要表現(xiàn)為S期的阻滯；野生株組和突變株組均可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生明顯凋亡,共培養(yǎng)24h及48h的凋亡率均高于對照組凋亡率(P0.05),但野生株組和突變株組之間凋亡率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5 iceA基因的炎癥相關(guān)因素研究 將H.pylori分別與SGC7901細(xì)胞共培養(yǎng)8h和24h后,檢測誘導(dǎo)IL-8的濃度,野生株組和突變株組與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。共培養(yǎng)8h野生株組和突變株組之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但共培養(yǎng)24h后,野生株組和突變株組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；熒光顯微鏡下顯示野生株和突變株均迅速粘附在SGC7901細(xì)胞表面,野生株和突變株的粘附率分別為32.49±2.96%和25.03±2.74%,但二組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1來自不同地區(qū)的幽門螺桿菌分離菌株iceA基因序列的分子特征有差異。 2 Hp27菌株和Hp27 iceA基因突變株可以抑制SGC7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；iceA基因的插入失活突變明顯改變細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期特征,對細(xì)胞凋亡率和粘附率的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。 3 Hp27菌株和Hp27 iceA基因突變株均可以誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞產(chǎn)生IL-8, iceA基因的插入失活突變導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生IL-8的濃度明顯減少。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2349396