【摘要】： 糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白CD160是一個(gè)27 kDa糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族,其基因定位于人染色體1q21.1。CD160最早發(fā)現(xiàn)于具有細(xì)胞毒活性的細(xì)胞表面,有一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域,由于剪接拼接的不同,CD160有四種異構(gòu)體,之前的研究都是針對(duì)于傳統(tǒng)的GPI-CD160。CD160的mRNA和蛋白在人CD56_(dim)CD16~+NK細(xì)胞,NKT細(xì)胞,腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IEL)高表達(dá),而在B細(xì)胞和脊細(xì)胞中不表達(dá)。組織中,CD160在脾、小腸、外周血淋巴細(xì)胞中表達(dá)較高,而在腦、肝、心、胸腺等表達(dá)較低。在NK細(xì)胞上,CD160也能廣泛的識(shí)別經(jīng)典和非經(jīng)典的MHCⅠ類分子,并在免疫應(yīng)答中起到正向刺激的作用。同時(shí),CD160跨家族結(jié)合HVEM,抑制CD4~+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌,并且降低CD3ζ鏈的磷酸化,產(chǎn)生新的共抑制信號(hào)途徑,在免疫應(yīng)答中起到負(fù)向抑制的作用。由于這一新的共抑制信號(hào)途徑發(fā)現(xiàn)較晚,CD160在許多疾病中的作用尚未可知。本研究旨在克隆人CD160基因,并建立CD160的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,研制抗人CD160的單克隆抗體,為進(jìn)一步的工作奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 第一部分人CD160基因的克隆、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)功能的初步研究 目的:克隆人CD160編碼區(qū)基因,構(gòu)建含有人CD160基因的重組載體,獲得穩(wěn)定表達(dá)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,并驗(yàn)證其是否具有功能性。 方法:從人外周血cDNA文庫中擴(kuò)增出了CD160的基因,并克隆入pMD19-T載體,另以VSIG4基因的cDNA為模板擴(kuò)增跨膜區(qū)基因。將T載體和跨膜區(qū)基因雙酶切后回收的兩個(gè)基因片段裝入pIRES2-EGFP載體,轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞。經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)CD160分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,并命名為L929/CD160TMV。采用流式細(xì)胞儀等分析鑒定CD160分子的表達(dá),并分析其和L929/HVEM共培養(yǎng)后的結(jié)合情況。 結(jié)果:成功克隆出了CD160的基因,構(gòu)建了含人CD160基因的重組載體,篩選并獲得穩(wěn)定表達(dá)人CD160分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/CD160TMV。初步檢測(cè)該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能結(jié)合L929/HVEM轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,證明其功能性。 結(jié)論:成功建立了可穩(wěn)定表達(dá)人CD160分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,為研制抗人CD160單克隆抗體提供了有效的免疫原。 第二部分抗人CD160單克隆抗體的研制 目的:研制鼠抗人CD160單克隆抗體,為探討CD160/HVEM相互作用對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響提供手段。 方法:以表達(dá)人CD160分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD160TMV為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),將免疫小鼠脾臟和骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0融合,并以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/CD160TMV和L929/mock分別作為陽性和陰性篩選細(xì)胞進(jìn)行篩選。采用間接免疫熒光標(biāo)記法流式細(xì)胞儀檢測(cè)、反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng),獲得特異性分泌鼠抗人CD160分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;采用Ig亞型快速定性試紙法,Dot-Blot和位點(diǎn)競爭結(jié)合抑制等實(shí)驗(yàn),對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株和單克隆抗體進(jìn)行鑒定。 結(jié)果:成功獲得1株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗CD160單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為3E2,經(jīng)Ig亞型快速定性試紙分析顯示,其重鏈為IgG1亞類,輕鏈則為κ鏈。Dot-Blot鑒定分析,3E2能與L929/CD160TMV細(xì)胞裂解液反應(yīng),而不與L929,L929/mock細(xì)胞裂解液反應(yīng)。競爭結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)顯示,3E2和商品化抗體識(shí)別不同抗原表位,不產(chǎn)生競爭作用。 結(jié)論:成功獲得1株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD160單抗的雜交瘤細(xì)胞株,且與商品化抗體識(shí)別不同抗原表位,從而為研究CD160/HVEM共抑制信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的抑制性調(diào)節(jié)提供手段。 綜上所述,本課題成功建立了可穩(wěn)定表達(dá)人CD160分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,為研制抗人CD160單克隆抗體提供了有效地免疫原并成功獲得1株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD160單抗的雜交瘤細(xì)胞株,與商品化抗體識(shí)別不同抗原表位,為研究CD160/HVEM共抑制信號(hào)對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響提供手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2345533