【摘要】： 糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白CD160是一個27 kDa糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族,其基因定位于人染色體1q21.1。CD160最早發(fā)現(xiàn)于具有細胞毒活性的細胞表面,有一個IgV樣結構域,由于剪接拼接的不同,CD160有四種異構體,之前的研究都是針對于傳統(tǒng)的GPI-CD160。CD160的mRNA和蛋白在人CD56_(dim)CD16~+NK細胞,NKT細胞,腸上皮內淋巴細胞(IEL)高表達,而在B細胞和脊細胞中不表達。組織中,CD160在脾、小腸、外周血淋巴細胞中表達較高,而在腦、肝、心、胸腺等表達較低。在NK細胞上,CD160也能廣泛的識別經(jīng)典和非經(jīng)典的MHCⅠ類分子,并在免疫應答中起到正向刺激的作用。同時,CD160跨家族結合HVEM,抑制CD4~+T細胞的增殖和細胞因子的分泌,并且降低CD3ζ鏈的磷酸化,產生新的共抑制信號途徑,在免疫應答中起到負向抑制的作用。由于這一新的共抑制信號途徑發(fā)現(xiàn)較晚,CD160在許多疾病中的作用尚未可知。本研究旨在克隆人CD160基因,并建立CD160的轉基因細胞株,研制抗人CD160的單克隆抗體,為進一步的工作奠定物質基礎。 第一部分人CD160基因的克隆、基因轉染細胞株的建立及其生物學功能的初步研究 目的:克隆人CD160編碼區(qū)基因,構建含有人CD160基因的重組載體,獲得穩(wěn)定表達基因的轉基因細胞,并驗證其是否具有功能性。 方法:從人外周血cDNA文庫中擴增出了CD160的基因,并克隆入pMD19-T載體,另以VSIG4基因的cDNA為模板擴增跨膜區(qū)基因。將T載體和跨膜區(qū)基因雙酶切后回收的兩個基因片段裝入pIRES2-EGFP載體,轉染L929細胞。經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達CD160分子的轉基因細胞株,并命名為L929/CD160TMV。采用流式細胞儀等分析鑒定CD160分子的表達,并分析其和L929/HVEM共培養(yǎng)后的結合情況。 結果:成功克隆出了CD160的基因,構建了含人CD160基因的重組載體,篩選并獲得穩(wěn)定表達人CD160分子的轉基因細胞L929/CD160TMV。初步檢測該轉基因細胞能結合L929/HVEM轉基因細胞,證明其功能性。 結論:成功建立了可穩(wěn)定表達人CD160分子的基因轉染細胞,為研制抗人CD160單克隆抗體提供了有效的免疫原。 第二部分抗人CD160單克隆抗體的研制 目的:研制鼠抗人CD160單克隆抗體,為探討CD160/HVEM相互作用對T細胞免疫應答的影響提供手段。 方法:以表達人CD160分子的基因轉染細胞L929/CD160TMV為免疫原,常規(guī)免疫BALB/c小鼠,利用B淋巴細胞雜交瘤技術,將免疫小鼠脾臟和骨髓瘤細胞株SP2/0融合,并以轉基因細胞L929/CD160TMV和L929/mock分別作為陽性和陰性篩選細胞進行篩選。采用間接免疫熒光標記法流式細胞儀檢測、反復篩選和多次克隆化培養(yǎng),獲得特異性分泌鼠抗人CD160分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株;采用Ig亞型快速定性試紙法,Dot-Blot和位點競爭結合抑制等實驗,對獲得的雜交瘤細胞株和單克隆抗體進行鑒定。 結果:成功獲得1株持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗CD160單克隆抗體的雜交瘤細胞株,命名為3E2,經(jīng)Ig亞型快速定性試紙分析顯示,其重鏈為IgG1亞類,輕鏈則為κ鏈。Dot-Blot鑒定分析,3E2能與L929/CD160TMV細胞裂解液反應,而不與L929,L929/mock細胞裂解液反應。競爭結合抑制實驗顯示,3E2和商品化抗體識別不同抗原表位,不產生競爭作用。 結論:成功獲得1株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD160單抗的雜交瘤細胞株,且與商品化抗體識別不同抗原表位,從而為研究CD160/HVEM共抑制信號對T細胞的抑制性調節(jié)提供手段。 綜上所述,本課題成功建立了可穩(wěn)定表達人CD160分子的基因轉染細胞,為研制抗人CD160單克隆抗體提供了有效地免疫原并成功獲得1株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD160單抗的雜交瘤細胞株,與商品化抗體識別不同抗原表位,為研究CD160/HVEM共抑制信號對T細胞免疫應答的影響提供手段。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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