【摘要】： 目的: RpoE是腸道致病菌中重要的一個(gè)sigma因子,能啟動(dòng)許多基因的表達(dá);本研究擬觀察傷寒沙門菌響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激時(shí)RpoE是否發(fā)揮作用以及高滲應(yīng)激早期RpoE對(duì)其他基因表達(dá)調(diào)節(jié)的研究。 方法: (1)采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌rpoE缺陷變異株。根據(jù)傷寒沙門菌rpoE基因序列,設(shè)計(jì)PCR特異性引物,并在引物5′-末端加上需要的酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增rpoE基因上、下游片段,用BglⅡ消化后,定向連接成rpoE基因的缺損性同源性核苷酸片段。將此片段膠回收后導(dǎo)入自殺質(zhì)粒pGMB151的BamHⅠ酶切位點(diǎn),將陽性質(zhì)粒用電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株(GIFU10007),進(jìn)行同源重組。用PCR觀察重組現(xiàn)象,將完全重組的菌株作為rpoE基因的缺陷變異株,并通過相應(yīng)的核苷酸序列分析加以確定。 (2)以生長時(shí)間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線,對(duì)比rpoE基因缺陷變異株與野生株在高滲、酸、氧、膽汁應(yīng)激條件下的生存情況。 (3)利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù),體外模擬高滲環(huán)境應(yīng)激,在低滲(50 mmol/L NaCl)LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傷寒沙門菌野生株和rpoE基因缺陷變異株4h(37℃,250r/min)至對(duì)數(shù)生長期,后轉(zhuǎn)入高滲(300 mmol/L NaCl)LB培養(yǎng)液中在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng),在高滲應(yīng)激早期(30min),分別提取傷寒沙門菌野生株和rpoE基因缺陷變異株的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光(cy3或cy5),與基因組芯片雜交,掃描后根據(jù)熒光信號(hào)分析各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,比較傷寒沙門菌野生株和rpoE基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激早期的基因表達(dá)譜差異;選擇部分差異表達(dá)基因設(shè)計(jì)并合成特異性引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR,以驗(yàn)證DNA芯片分析結(jié)果。 結(jié)果: (1)經(jīng)PCR及序列分析證實(shí)變異株中rpoE基因缺失了288個(gè)堿基,表明成功構(gòu)建傷寒沙門菌rpoE基因缺陷變異株; (2)生長曲線提示rpoE基因缺陷變異株在高滲、酸、氧應(yīng)激條件下生存能力明顯弱于野生株(P0.05);在膽汁應(yīng)激下生存能力與野生株比較沒有明顯差異。 (3)基因芯片分析:高滲應(yīng)激30分鐘后,相比野生株,rpoE基因缺陷株有135個(gè)基因表達(dá)明顯變化,其主要涉及部分熱休克蛋白、鞭毛蛋白、侵襲蛋白、外膜蛋白及一些酶類、雙組分調(diào)控系統(tǒng)phoP/phoQ和大量未知功能的推測(cè)蛋白。選取其中部份差異表達(dá)基因利用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示所選基因與基因芯片的表達(dá)情況一致。 結(jié)論: 成功構(gòu)建了傷寒沙門菌rpoE基因缺陷株,在高滲、酸、氧應(yīng)激條件下rpoE基因缺陷株的生存能力明顯弱于野生株(P0.05);RpoE在傷寒沙門菌高滲應(yīng)激早期的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Objective: RpoE is an important sigma factor in intestinal pathogenic bacteria, which can activate the expression of many genes. The purpose of this study was to investigate whether RpoE plays a role in the response of Salmonella typhimurium to environmental stress and whether RpoE regulates the expression of other genes in the early stage of hyperosmotic stress. Methods: (1) rpoE deficient mutant of Salmonella typhimurium was prepared by suicide plasmid mediated homologous recombination. According to the rpoE gene sequence of Salmonella typhimurium, a specific PCR primer was designed, and the necessary endonuclease site was added to the 5- terminal of the primer. The upstream and downstream fragments of rpoE gene were amplified and digested with Bgl 鈪，

本文編號(hào)：2345441