【摘要】： RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double strands RNA,dsRNA)引起的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程,它具有系統(tǒng)性的特性,即該現(xiàn)象可以在細胞或組織間傳遞,或從親代傳遞到子代。線蟲sid-1基因是系統(tǒng)性RNAi關(guān)鍵基因,SID-1蛋白可能作為一種膜通道在系統(tǒng)性RNAi中起到轉(zhuǎn)運dsRNA的作用。在大鼠、小鼠、人等多種動物中均存在sid1的同源基因,根據(jù)其序列同源性又可分為兩個家族sidt1和sidt2,本論文對小鼠sidt2基因的結(jié)構(gòu)和功能進行了相關(guān)的初步研究。 小鼠sidt2基因包括兩條序列,即BC051101和BC023957,它們的編碼區(qū)僅長度相差63個堿基,因此將其分別命名為sidt2(1)和sidt2(s)。我們通過RT-PCR檢測了兩條序列的組織表達譜。我們還通過基因組序列比對及PCR對二者進行了染色體定位,并構(gòu)建可變剪接報告載體,觀察其在細胞內(nèi)的剪接行為,驗證了二者為同一基因的可變剪接產(chǎn)物。另外,我們通過RNAi技術(shù)研究了剪接因子CLK2、SNRPB及hnRNP A1對sidt2可變剪接的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制上述剪接因子表達時,內(nèi)源的sidt2基因的剪接形式并未發(fā)生明顯變化,推測可能與可變剪接機制復(fù)雜、參與其中的剪接因子種類復(fù)雜等有關(guān);而hnRNPA1的抑制則會導(dǎo)致可變剪接報告載體載細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄受到明顯抑制。 我們還對小鼠sidt2(l/s)進行了蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細胞定位的研究,結(jié)果表明SIDT2(L/S)為多重跨膜蛋白,主要定位在細胞的膜系統(tǒng)。根據(jù)大鼠與小鼠sidt2(l)基因的高度同源性,我們分離培養(yǎng)了大鼠的原代肝細胞,并通過RT-PCR驗證其中sidt2(l)占大多數(shù)。siRNA導(dǎo)入實驗發(fā)現(xiàn)FAM標(biāo)記的siRNA能夠在不借助脂質(zhì)體的條件下進入大鼠原代肝細胞,提示sidt2(l)基因可能具有協(xié)助siRNA導(dǎo)入細胞的作用。
[Abstract]:RNA interference (RNA interference,RNAi) is a sequence-specific post-transcriptional gene silencing process caused by double-stranded RNA (double strands RNA,dsRNA. It has a systematic characteristic, that is, the phenomenon can be transmitted between cells or tissues, or from parent to offspring. Nematode sid-1 gene is the key gene of systemic RNAi. SID-1 protein may act as a membrane channel to transport dsRNA in systemic RNAi. The homologous genes of sid1 exist in rats, mice, human and other animals. According to their homology, they can be divided into two families: sidt1 and sidt2,. In this paper, the structure and function of mouse sidt2 gene were studied. Mouse sidt2 gene consists of two sequences, BC051101 and BC023957,. Their coding region is only 63 bases different in length, so they are named sidt2 (1) and sidt2 (s). Respectively. We detected the tissue expression profiles of two sequences by RT-PCR. We also mapped the chromosomes by genomic sequence alignment and PCR, and constructed the variable splicing report vector, and observed the splicing behavior in the cells, and verified that they were the same gene variable splicing products. In addition, we studied the effect of splicing factor CLK2,SNRPB and hnRNP A1 on sidt2 variable splicing by RNAi technique. It was found that the splicing form of endogenous sidt2 gene did not change significantly when the splicing factor was inhibited. It may be related to the complexity of the variable splicing mechanism and the complexity of the splicing factors involved in it. The inhibition of hnRNPA1 resulted in significant inhibition of transcription in the cells carrying variable splicing report vector. We also studied the protein structure prediction and subcellular localization of mouse sidt2 (l / s). The results showed that SIDT2 (L / S) was a multiple transmembrane protein, mainly located in the cell membrane system. According to the high homology of sidt2 (l) gene between rats and mice, we isolated and cultured rat primary hepatocytes. The results of RT-PCR analysis showed that sidt2 (l) was the majority of them. The results of siRNA transfection showed that the siRNA labeled by FAM could enter into rat primary hepatocytes without liposome, suggesting that sidt2 (l) gene might be helpful to the introduction of siRNA into rat hepatocytes.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R346

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本文編號：2341142