【摘要】： 活性氧族(reactive oxygen species,ROS),例如超氧陰離子自由基(O_2~-)和H_2O_2等都能造成機體氧化性應(yīng)激反應(yīng),成為許多疾病比如肝損傷、肺損傷的誘導因子。超氧化物歧化酶(SOD)能夠分解O_2~-,從而可防御由于氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的損傷。然而體內(nèi)試驗卻表明,SOD在抗炎、抗纖維化中發(fā)揮的作用不夠理想,需要的劑量較大。造成SOD在動物實驗和臨床試驗療效不理想的原因是由于SOD不理想的藥代動力學特點,即體內(nèi)半衰期短(t_(1/2)大約6min)。為了改善SOD的藥代動力學性質(zhì),提高SOD的作用效果,本文設(shè)計研究了具有長效和組織或者細胞靶向性SOD,即用陰離子多糖肝素修飾的SOD(Hep-SOD)和用陽離子多糖N,N,N-三甲基季銨化殼聚糖(TMC)修飾的SOD(TMC-SOD),及它們的理化與生物學性質(zhì)和對ROS引起的損傷的作用與機制。 本論文的主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下。 1 Hep-SOD與TMC-SOD的制備 采用高碘酸鈉氧化法活化肝素,用活化的肝素在pH9.5、0.3 mol/L碳酸鹽溶液中對SOD進行化學修飾,反應(yīng)產(chǎn)物通過電泳鑒定。對該修飾反應(yīng)液進行預(yù)處理后,用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析進行修飾酶的分級分離,制備Hep-SOD結(jié)合物。 EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)縮合法制備TMC-SOD。為增加殼聚糖的水溶性和陽電荷性質(zhì),先將殼聚糖用H_2O_2法降解,再通過N-位三甲基化,得到TMC。TMC在縮合劑EDC的存在下對SOD進行修飾,得到TMC-SOD,修飾反應(yīng)液進行預(yù)處理后,用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析進行修飾酶的分級分離得到TMC-SOD結(jié)合物。 SOD活性測定結(jié)果表明,天然SOD、TMC-SOD以及Hep-SOD酶活分別為3250、2830和2770U/mg。采用MTT法測定證實,SOD的兩種結(jié)合物均無細胞毒性。 2 Hep-SOD、TMC-SOD的二級結(jié)構(gòu)分析 采用圓二色譜法(CD)對SOD及其修飾物的二級結(jié)構(gòu)進行研究,并比較其差別。結(jié)果顯示,在溶液狀態(tài)SOD與其兩種結(jié)合物的CD圖譜略有差異。具體來講,Hep-SOD比未修飾的SOD分子結(jié)構(gòu)中α-helix比例增加(24.50%vs23.50%),而β-sheet的含量降低(48.3%vs49.8%),同時,Random.Coil成分比例均略有下降(30.80%vs 31.90%)。研究表明,SOD經(jīng)過TCM修飾以后在二級結(jié)構(gòu)上也發(fā)生了一定的變化,主要表現(xiàn)在α-helix降低(20.70%vs 23.50%):β-構(gòu)象的含量升高(53.7%vs 49.8%),同時,Random.Coil的含量升高(37.90%vs31.90%)。但總體而言,SOD經(jīng)過修飾前后對二級結(jié)構(gòu)的影響都不大,這與修飾前后對SOD酶活的影響不大一致。 3 SOD結(jié)合物對巨噬細胞的靶向性研究 3.1 SOD結(jié)合物對細胞內(nèi)SOD酶活、總抗氧能力(T-AOC)、超氧陰離子釋放的影響 本研究考察了SOD結(jié)合物對淀粉誘導的小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)SOD酶活力和T-AOC以及對抑制o_2~-釋放的影響。結(jié)果顯示,正常小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)SOD酶活性為48.344±5.39 U/mg蛋白,巨噬細胞與各用藥組共同孵育以后細胞內(nèi)酶活性均升高,其中SOD組細胞內(nèi)酶活升高到62.92±6.00 U/mg蛋白,與正常細胞內(nèi)酶活相比差異不顯著(P＞0.5),而Hep-SOD組和TMC-SOD組細胞內(nèi)酶活性升高均非常顯著,分別達到162.2±7.20和408.04±15.91U/mg蛋白,與正常細胞內(nèi)酶活相比具有顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)果還表明,正常小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)T-AOC為9.50±1.49U/mg蛋白,巨噬細胞與各用藥組共同孵育以后細胞T-AOC均升高,SOD組細胞內(nèi)T-AOC升高到11.89±2.28U/mg蛋白,與正常細胞內(nèi)T-AOC相比差異不顯著(P＞0.5),而Hep-SOD組和TMC-SOD組細胞內(nèi)T-AOC升高非常顯著,分別達到32.39±2.94U/mg蛋白和71.36±5.35U/mg蛋白(P＜0.01)。研究顯示,Hep-SOD和TMC-SOD均能夠抑制巨噬細胞O_2~-的釋放,影響趨勢與各用藥組對細胞內(nèi)SOD酶活性的影響變化趨勢基本一致,TMC-SOD用藥組的抑制作用顯著高于其他用藥組。 本研究中我們還發(fā)現(xiàn),秋水仙素能夠明顯影響SOD兩種多糖修飾物對孵育細胞內(nèi)的酶活性、T-AOC以及孵育巨噬細胞抑制O_2~-的能力。尤其是TMC-SOD組,加入秋水仙素能使細胞內(nèi)酶活性及T-AOC升高的趨勢降低大約50%。這一發(fā)現(xiàn)與以前文獻報導的用六亞甲基二胺作為陽離子修飾劑修飾SOD對秋水仙素不敏感不一致。有文獻報導,巨噬細胞表面存在大量的甘露糖受體,該受體不僅可以與甘露糖結(jié)合,還能夠與殼聚糖等結(jié)合,卻不能與六亞甲基二胺結(jié)合。SOD經(jīng)過TMC修飾后可以和甘露糖受體結(jié)合,而SOD經(jīng)六亞甲基二胺修飾后不能與甘露糖受體結(jié)合。秋水仙素可能就是通過影響TMC-SOD與甘露糖受體的結(jié)合而影響TMC-SOD的細胞內(nèi)酶活性等。 3.2流式細胞技術(shù)檢測SOD結(jié)合物對巨噬細胞的結(jié)合能力 本研究借助流式細胞儀檢測考察SOD及其兩種結(jié)合物對巨噬細胞的結(jié)合能力。FITC標記的SOD、Hep-SOD以及TMC-SOD與小鼠腹腔巨噬細胞共同孵育,結(jié)果表明,TMC-SOD對細胞的結(jié)合能力最強,其次是Hep-SOD,陽性率分別為95.36%和29.2%,而SOD孵育組陽性率只有22%;當延長孵育時間達到2h,陽性率均升高,其中SOD、Hep-SOD組分別升高到37.64%和51.81%。 3.3激光共聚焦顯微鏡技術(shù)研究SOD及其修飾物巨噬細胞內(nèi)分布 FITC標記的SOD及SOD衍生物與巨噬細胞共孵育1h后,SOD組的熒光信號較弱,而Hep-SOD組和TMC-SOD組的熒光信號與SOD組相比有不同程度的增強,其中,Hep-SOD組熒光略強于SOD組。FITC標記的SOD及SOD衍生物與巨噬細胞共孵育2h后,熒光強度均比1h時的相同藥物組有不同程度的增強,且兩個修飾物組均表現(xiàn)出比SOD組更強的熒光強度。 4 Hep-SOD結(jié)合物對CCl_4誘導的急性肝損傷和肝纖維化的防治作用 4.1 Hep-SOD結(jié)合物對CCl_4誘導的急性肝損傷的作用 本研究采用CCl_4腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷,立即尾靜脈注射給藥。用藥24h取血測定血清LDH、GSH和GOT/GPT活性;取肝組織測定MDA含量。結(jié)果顯示,Hep-SOD以及Hep+SOD組轉(zhuǎn)氨酶濃度均低于模型組,但高于正常對照組。結(jié)果還顯示腹腔注射CCl_4不僅導致血液GOT/GPT、LDH以及肝組織MDA濃度升高,還同時降低GSH的濃度。研究發(fā)現(xiàn),尾靜脈注射Hep-SOD能夠顯著降低LDH,同時增高GSH的濃度。各生化指標顯示,與天然SOD相比,Hep-SOD保肝作用更為顯著,Hep-SOD對CCl_4誘導的急性壞死性肝損傷具有很理想的預(yù)防和保護作用。肝素用藥組在本實驗中沒發(fā)現(xiàn)有明顯的療效。 4.2 Hep-SOD結(jié)合物對CCl_4誘導的肝纖維化的防治作用 本研究采用CCl_4腹腔注射,每周2次,連續(xù)12周誘導小鼠肝纖維化,在CCl_4注射后立即腹腔注射給藥,最后一次用藥24h后眼球取血處死動物,進行以下實驗。 (1)羥脯氨酸測定 采用測定小鼠肝組織羥脯氨酸含量為指標考察小鼠肝臟的膠原水平。結(jié)果顯示,連續(xù)12周腹腔注射CCl_4后,肝組織羥脯氨酸含量顯著升高(549±39vs.1684±14μg/g濕肝重,P＜0.05);與模型組相比,各用藥組羥脯氨酸含量均顯著降低,SOD用藥組羥脯氨酸含量為(320±57μg/g濕肝重,P＜0.5),而Hep-SOD用藥組作用最明顯(206±16μg/g濕肝重,P＜0.01)。 (2)肝臟病理學檢測 研究表明,Hep-SOD用藥組和Hep+SOD用藥組均能夠有效降低CCl_4誘導的小鼠肝臟纖維化程度。在CCl_4連續(xù)注射12周,模型組出現(xiàn)纖維組織增生明顯,假小葉形成,形成完整的增厚的、明顯的纖維組織隔,肝細胞濁腫變性,部分呈氣球樣變,大量炎癥細胞浸潤,有片狀壞死灶;部分肝細胞嗜酸性變性,細胞核縮小。Hep-SOD用藥組以及肝素+SOD混合用藥組能夠有效降低上述病變程度,其中Hep-SOD用藥組作用最明顯。纖維化病例積分統(tǒng)計進一步說明,Hep-SOD用藥組能夠有效緩解CCl_4誘導的小鼠肝臟纖維化程度。 (3)Hep-SOD對小鼠肝組織相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 采用Real-time PCR(RT-PCR)測定Hep-SOD對小鼠肝組織TGF-β1、MMP-2、fibronectin和collage-ⅠmRNA轉(zhuǎn)錄影響。結(jié)果顯示,連續(xù)注射CCl_4 12周能使肝組織TGF-β1 mRNA水平提高4倍,而Hep-SOD能夠有效抑制這種升高趨勢。研究還顯示,連續(xù)注射CCl_4同樣能夠使MMP-2、fibronectin和collage-ⅠmRNA轉(zhuǎn)錄提高,但同時注射Hep-SOD能夠抑制上述mRNA升高的趨勢。 (4)Hep-SOD對小鼠肝組織TGF-β1蛋白表達水平的影響 本研究借助Western blotting技術(shù)證明,連續(xù)CCl_4注射能夠使肝組織TGF-β1表達顯著提高,而這種升高趨勢在Hep-SOD組、Hep+SOD混合用藥組、SOD組以及肝素用藥組均受到一定程度的抑制,而Hep-SOD用藥組作用最為明顯。 5 TMC-SOD結(jié)合物對CCl_4誘導的急性肝損傷和肝纖維化的防治作用 5.1 TMC-SOD對急性肝損傷的保護作用 采用對CCl_4注射的小鼠尾靜脈注射TMC-SOD。用藥后24h取血處死,測定血液生化指標GOT/GPT、GSH、LDH以及肝組織中MDA含量。結(jié)果顯示,CCl_4誘導急性肝損傷通過降低GSH水平、提高脂質(zhì)過氧化來改變組織氧化還原狀態(tài)。而上述變化在TMC-SOD用藥組以及TMC+SOD用藥組均得到部分抑制。各生化指標顯示,與其他用藥組相比,TMC-SOD組對急性肝損傷的改善作用最顯著。 5.2 TMC-SOD對肝纖維化的保護作用 本研究采用TMC-SOD和CCl_4同時腹腔注射小鼠,每周兩次,連續(xù)12周。組織病理學以及羥脯氨酸含量測定均表明TMC-SOD能夠有效防治肝纖維化。本研究還采用RT-PCR測定TGF-β1、MMP-2以及collagen-Ⅰ等的mRNA。測定結(jié)果顯示,CCl_4連續(xù)注射12周能夠使上述mRNA顯著升高,而TMC-SOD用藥組能夠有效降低上述mRNA水平。此外,本研究還采用Western blotting對小鼠肝組織勻漿中TGF-β1蛋白水平進行檢測,結(jié)果同樣顯示,TMC-SOD用藥組能夠有效降低TGF-β1的含量。 以上結(jié)果綜合表明,TMC-SOD能夠有效防治急性肝損傷或肝纖維化。6采用~(125)I標記法和TCA沉淀法測定SOD及其兩種多糖結(jié)合物在正常小鼠的血液半衰期和組織分布 在小鼠體內(nèi)對SOD的兩種多糖結(jié)合物進行了藥代動力學研究。首先制備~(125)I標記的SOD及其結(jié)合物——~(125)I-SOD、~(125)I-Hep-SOD和~(125)I-TMC-SOD,小鼠單次給藥后,三氯醋酸(TCA)沉淀法測定血漿、組織的放射性含量,3p97軟件擬合藥物動力學模型,并計算相應(yīng)參數(shù)。結(jié)果顯示,~(125)I-Hep-SOD和~(125)I-TMC-SOD單次靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的動力學過程符合兩室模型。在相同劑量條件下,~(125)I-Hep-SOD和~(125)I-TMC-SOD分布相半衰期t_1/2a、消除相半衰期t_1/2β和AUC均有所增加。 體內(nèi)分布試驗結(jié)果表明,~(125)I-Hep-SOD進入血液后首先迅速聚集到肝臟,5min和1h在肝臟組織中分別高達21.38±3.35%ID/g和14.38±2.67%ID/g;而~(125)I-TMC-SOD進入血液后則到肺臟蓄積,5min和1h在肺臟組織中分別高達24.98±1.87%ID/g和16.13±1.19%ID/g。 7本研究取得的主要結(jié)論 (1)成功制備分離得到了Hep-SOD和TMC-SOD兩種多糖結(jié)合物,并借助CD技術(shù)對兩種結(jié)合物二級結(jié)構(gòu)進行了分析,發(fā)現(xiàn)該制備過程對SOD二級結(jié)構(gòu)影響不大。 (2)聚陰離子黏多糖——肝素以及聚陽離子黏多糖——TMC是較理想的巨噬細胞靶向性修飾劑,其中TMC的靶向性修飾效果更好。 (3)Hep-SOD通過升高GSH的濃度和降低TGF-β1的表達,能夠防治CCl_4造成的急性肝損傷和肝纖維化,該防治作用可能是結(jié)合物的抗氧化作用和抗炎作用共同作用的結(jié)果。 (4)TMC-SOD結(jié)合物防治急性肝損傷和肝纖維化作用顯著。TMC-SOD將有望成為治療由于氧化應(yīng)激作用導致的肝纖維化和急性肝損傷的有效藥物。 (5)與天然SOD相比,TMC-SOD以及Hep-SOD的血液半衰期顯著延長;TMC-SOD和Hep-SOD均對肺臟有靶向性。 (6)SOD的肝素或者TMC化學修飾物能夠有效治療自由基介導的炎癥反應(yīng);TMC-SOD以及Hep-SOD都有望成為防治ROS導致的組織損傷的理想藥物。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 劉婧;豬血超氧化物歧化酶的提取、性質(zhì)及其化學修飾研究[D];吉林大學;2011年

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本文編號：2340326