【摘要】： 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells ESCs)是具有無限自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞,其既可通過對稱分裂保持不分化狀態(tài),也可分化形成如淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。ES細(xì)胞自我更新必定要依賴于多個信號通路的協(xié)同作用來維持,對其調(diào)控機(jī)制的研究不僅對了解胚胎發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義,也能為胚胎干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。然而目前對于其相關(guān)信號通路及調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚,因此探索和研究新的信號分子對于進(jìn)一步了解胚胎干細(xì)胞自我更新調(diào)控機(jī)制及分化機(jī)理非常必要。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells CSCs)是腫瘤細(xì)胞中存在的一群與胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性極為相似的細(xì)胞,近來研究結(jié)果顯示,胚胎干細(xì)胞中的自我更新標(biāo)志分子Nanog、Oct-4等在腫瘤干細(xì)胞中也異常表達(dá),并參與其自我更新的調(diào)控,提示兩者可能存在相同的干性調(diào)控通路。癌基因Bmi-1在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),并在維持CSCs及造血、神經(jīng)等成體干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮作用。胚胎干細(xì)胞中也檢測到該基因的高表達(dá),那么Bmi-1是否也同樣參與了胚胎干細(xì)胞中多能性的維持則是我們感興趣的問題。 為了研究Bmi-1分子在胚胎干細(xì)胞中的作用,本實驗首先構(gòu)建了Bmi-1鼠源真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞系CCE并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,最后通過檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株與對照細(xì)胞在增殖、自我更新和分化等方面差異探討B(tài)mi-1分子對胚胎干細(xì)胞自我更新維持的作用。研究內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個方面: 1. Bmi-1過表達(dá)載體的構(gòu)建:Bmi-1mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)mBmiCDSF/mBmiCDSR引物擴(kuò)增后,得到含有EcoRI和SalI酶切位點的Bmi-1全長編碼序列,將該序列克隆至pCI-GFP載體中,得到N端融合表達(dá)EGFP熒光蛋白的pCI-GFP-bmi1真核表達(dá)載體。 2.表達(dá)載體pCI-GFP-bmi1在胚胎干細(xì)胞系CCE中的表達(dá):將該表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染CCE細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染pCI-GFP-bmi1細(xì)胞中,熒光蛋白表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi);而轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pCI-GFP的細(xì)胞中,熒光蛋白均勻分布。 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的篩選和鑒定:將轉(zhuǎn)染細(xì)胞于篩選培養(yǎng)液(含400μg/ml G418的ESC培養(yǎng)液)培養(yǎng)12天后,篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,分別為過表達(dá)Bmi-1的pCGB/CCE和對照株pCG/CCE。DAPI染色后于共聚焦顯微鏡下觀察可見,pCGB/CCE細(xì)胞中EGFP-bmi1融合蛋白特異性表達(dá)于細(xì)胞核中,與DAPI染色的細(xì)胞核重疊,并呈顆粒狀分布。半定量RT-PCR和免疫印跡結(jié)果顯示EGFP-bmi1融合蛋白正確表達(dá)。 4. Bmi-1對ES細(xì)胞增殖的影響:細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,與對照株pCG/CCE相比,在同等培養(yǎng)條件下,pCGB/CCE細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。在LIF+培養(yǎng)條件下尤其顯著,在第5天可見細(xì)胞增殖數(shù)目的明顯差異。說明過表達(dá)Bmi-1有助于促進(jìn)ES細(xì)胞增殖。 5. Bmi-1對ES細(xì)胞自我更新能力的影響:克隆形成實驗結(jié)果顯示,在LIF(+10ng/ml)和LIF-1(1ng/ml)培養(yǎng)條件下,pCG/CCE細(xì)胞形成的AP染色陽性克隆率分別為45.7%和26.7%,與之相比,過表達(dá)Bmi-1的pCGB/CCE細(xì)胞AP染色陽性克隆率則明顯增高,分別為71.4%和62%。對細(xì)胞中干性分子檢測的結(jié)果顯示:與對照株pCG/CCE相比,過表達(dá)Bmi-1的pCGB/CCE細(xì)胞中,干性分子nanog的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),oct-4和sox2分子的表達(dá)也略有上調(diào)。而c-myc的mRNA表達(dá)水平則顯著降低。隨后對Nanog和c-Myc行蛋白印跡結(jié)果顯示與分子水平表達(dá)一致。說明Bmi-1可促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新。 6. Bmi-1對ES細(xì)胞分化的影響:無LIF篩選培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)及誘導(dǎo)形成EB分化后,對細(xì)胞中的干性分子和分化標(biāo)志分子進(jìn)行檢測。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,與對照相比,過表達(dá)Bmi-1的細(xì)胞中,干性分子如Nanog等表達(dá)較高而分化標(biāo)志分子如GATA6、GATA4表達(dá)則較低。說明Bmi-1分子的過表達(dá)會阻礙ES細(xì)胞分化,特別是原始內(nèi)胚層方向。 綜上所述,本研究分別從增殖、自我更新和分化三個方面探討了過表達(dá)癌基因Bmi-1對胚胎干細(xì)胞的影響。研究結(jié)果顯示過表達(dá)Bmi-1有助于促進(jìn)ES細(xì)胞的自我更新及增殖能力,并阻礙其分化。研究結(jié)果表明Bmi-1參與了對胚胎干細(xì)胞自我更新及分化的調(diào)控,為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ),并為深入了解ES細(xì)胞發(fā)育機(jī)制提供了新的靶點和線索。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 James A Thomson;;Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency[J];Cell Research;2007年01期

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本文編號：2339038