發(fā)布時間：2018-11-17 21:07

【摘要】： 胚胎干細胞(embryonic stem cells ESCs)是具有無限自我更新能力和多向分化潛能的細胞,其既可通過對稱分裂保持不分化狀態(tài),也可分化形成如淋巴細胞、造血細胞、神經細胞等多種細胞。ES細胞自我更新必定要依賴于多個信號通路的協(xié)同作用來維持,對其調控機制的研究不僅對了解胚胎發(fā)育的分子機制具有重要意義,也能為胚胎干細胞的臨床應用提供理論基礎。然而目前對于其相關信號通路及調控機制尚不完全清楚,因此探索和研究新的信號分子對于進一步了解胚胎干細胞自我更新調控機制及分化機理非常必要。腫瘤干細胞(cancer stem cells CSCs)是腫瘤細胞中存在的一群與胚胎干細胞生物學特性極為相似的細胞,近來研究結果顯示,胚胎干細胞中的自我更新標志分子Nanog、Oct-4等在腫瘤干細胞中也異常表達,并參與其自我更新的調控,提示兩者可能存在相同的干性調控通路。癌基因Bmi-1在多種腫瘤細胞中高表達,并在維持CSCs及造血、神經等成體干細胞的自我更新中發(fā)揮作用。胚胎干細胞中也檢測到該基因的高表達,那么Bmi-1是否也同樣參與了胚胎干細胞中多能性的維持則是我們感興趣的問題。 為了研究Bmi-1分子在胚胎干細胞中的作用,本實驗首先構建了Bmi-1鼠源真核表達載體,轉染胚胎干細胞系CCE并獲得穩(wěn)定轉染株,最后通過檢測穩(wěn)定轉染株與對照細胞在增殖、自我更新和分化等方面差異探討B(tài)mi-1分子對胚胎干細胞自我更新維持的作用。研究內容和結果主要包括以下幾個方面: 1. Bmi-1過表達載體的構建:Bmi-1mRNA逆轉錄產物經mBmiCDSF/mBmiCDSR引物擴增后,得到含有EcoRI和SalI酶切位點的Bmi-1全長編碼序列,將該序列克隆至pCI-GFP載體中,得到N端融合表達EGFP熒光蛋白的pCI-GFP-bmi1真核表達載體。 2.表達載體pCI-GFP-bmi1在胚胎干細胞系CCE中的表達:將該表達載體瞬時轉染CCE細胞,熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達。轉染pCI-GFP-bmi1細胞中,熒光蛋白表達于細胞核內;而轉染對照質粒pCI-GFP的細胞中,熒光蛋白均勻分布。 3.穩(wěn)定轉染株的篩選和鑒定:將轉染細胞于篩選培養(yǎng)液(含400μg/ml G418的ESC培養(yǎng)液)培養(yǎng)12天后,篩選得到穩(wěn)定轉染株,分別為過表達Bmi-1的pCGB/CCE和對照株pCG/CCE。DAPI染色后于共聚焦顯微鏡下觀察可見,pCGB/CCE細胞中EGFP-bmi1融合蛋白特異性表達于細胞核中,與DAPI染色的細胞核重疊,并呈顆粒狀分布。半定量RT-PCR和免疫印跡結果顯示EGFP-bmi1融合蛋白正確表達。 4. Bmi-1對ES細胞增殖的影響:細胞增殖實驗結果顯示,與對照株pCG/CCE相比,在同等培養(yǎng)條件下,pCGB/CCE細胞增殖能力明顯增強。在LIF+培養(yǎng)條件下尤其顯著,在第5天可見細胞增殖數(shù)目的明顯差異。說明過表達Bmi-1有助于促進ES細胞增殖。 5. Bmi-1對ES細胞自我更新能力的影響:克隆形成實驗結果顯示,在LIF(+10ng/ml)和LIF-1(1ng/ml)培養(yǎng)條件下,pCG/CCE細胞形成的AP染色陽性克隆率分別為45.7%和26.7%,與之相比,過表達Bmi-1的pCGB/CCE細胞AP染色陽性克隆率則明顯增高,分別為71.4%和62%。對細胞中干性分子檢測的結果顯示:與對照株pCG/CCE相比,過表達Bmi-1的pCGB/CCE細胞中,干性分子nanog的mRNA表達水平明顯上調,oct-4和sox2分子的表達也略有上調。而c-myc的mRNA表達水平則顯著降低。隨后對Nanog和c-Myc行蛋白印跡結果顯示與分子水平表達一致。說明Bmi-1可促進ES細胞自我更新。 6. Bmi-1對ES細胞分化的影響:無LIF篩選培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)及誘導形成EB分化后,對細胞中的干性分子和分化標志分子進行檢測。半定量RT-PCR結果顯示,與對照相比,過表達Bmi-1的細胞中,干性分子如Nanog等表達較高而分化標志分子如GATA6、GATA4表達則較低。說明Bmi-1分子的過表達會阻礙ES細胞分化,特別是原始內胚層方向。 綜上所述,本研究分別從增殖、自我更新和分化三個方面探討了過表達癌基因Bmi-1對胚胎干細胞的影響。研究結果顯示過表達Bmi-1有助于促進ES細胞的自我更新及增殖能力,并阻礙其分化。研究結果表明Bmi-1參與了對胚胎干細胞自我更新及分化的調控,為進一步研究其調控機制奠定了基礎,并為深入了解ES細胞發(fā)育機制提供了新的靶點和線索。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 James A Thomson;;Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency[J];Cell Research;2007年01期

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本文編號：2339038