【摘要】：乳酸乳球菌是一種革蘭氏陽性菌，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)，被認為是安全的。乳酸乳球菌作為一種理想的黏膜輸送載體，具有抗原性弱、不產(chǎn)生胞外酶和不在胃腸道內(nèi)定植的優(yōu)點，盡管乳酸乳球菌在表達細菌或病毒的抗原基因方面獲得了很多突破性的進展，但是乳酸乳球菌在預(yù)防高致病性禽流感H5N1病毒感染方面的研究還未開展。 高致病性禽流感H5N1病毒給人類和動物的健康帶來了極大的威脅。病毒基因組中的血凝素（hemagglutinin, HA）基因容易發(fā)生變異，從而導(dǎo)致抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變，最終給防治禽流感病毒感染帶來極大的困難與挑戰(zhàn)。HA蛋白作為禽流感病毒的保護性抗原，已經(jīng)成為禽流感疫苗開發(fā)領(lǐng)域的研究重點與熱點。 在本論文中，我們以高致病性禽流感病毒H5N1亞型的HA基因或HA1基因作為研究對象，利用非常成熟的nisin控制表達（NIsin Controlled Expression，NICE）系統(tǒng)，構(gòu)建不同表達類型的重組乳酸乳球菌，并對聯(lián)合佐劑或經(jīng)腸溶膠囊包裹后的免疫效果進行評價，目的是建立以重組乳酸乳球菌為基礎(chǔ)的疫苗輸送技術(shù)平臺，為防治高致病性禽流感病毒的感染提供可行的思路，進一步地，為拓寬到其它病毒抗原基因的研究提供了強有力的基礎(chǔ)。 本論文主要創(chuàng)新點有： （1）基于nisin誘導(dǎo)的表達控制系統(tǒng)，首次構(gòu)建了三種不同表達類型的重組乳酸乳球菌。 （2） HA蛋白或HA1蛋白準確定位表達在乳酸乳球菌的不同部位。 （3）聯(lián)合佐劑免疫后，表面展示型和分泌型重組乳酸乳球菌分別提供100％和80％的保護效率。 （4）首次報道，經(jīng)腸溶膠囊包裹后，表面展示型和分泌型重組乳酸乳球菌能提供100％的免疫保護。 （5）成功地構(gòu)建了以表面展示型和分泌型重組乳酸乳球菌為基礎(chǔ)的禽流感疫苗黏膜輸送技術(shù)平臺。通過常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建了三種不同表達類型的重組乳酸乳球菌，即：非分泌型重組乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8150-HA)、分泌型重組乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-HA)以及表面展示展示型重組乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)。簡言之，在構(gòu)建pNZ8150-HA時，以質(zhì)粒pGEM-HA為模板，在上、下游引物中分別設(shè)計Sca I和Hind III酶切位點，經(jīng)PCR擴增得到的產(chǎn)物HA基因與不帶分泌信號的表達質(zhì)粒pNZ8150分別經(jīng)過Sca I/Hind III酶切后進行連接，將連接產(chǎn)物命名為：pNZ8150-HA。 同理，以帶有分泌信號ssUSP的表達質(zhì)粒pNZ8110作為骨架，以質(zhì)粒pGEM-HA為模板，在上、下游引物中分別設(shè)計Nae I和Hind III位點，通過PCR反應(yīng)得到的產(chǎn)物HA基因與帶有分泌信號的表達質(zhì)粒pNZ8110分別經(jīng)Nae I/HindIII酶切后進行連接，連接產(chǎn)物命名為：pNZ8110-HA。 表面展示型表達載體的構(gòu)建首先以枯草芽孢桿菌基因組為模板，在上游引物中設(shè)計Spe I酶切位點，在下游引物中設(shè)計linker-1(5'tcctcctggggatcc3')，通過PCR反應(yīng)得到產(chǎn)物pgsA基因。其次，以質(zhì)粒pGEM-HA為模板，在上游引物中設(shè)計linker-2(5'ggatccccaggagga3')，在下游引物中設(shè)計Hind III酶切位點，通過PCR反應(yīng)得到的產(chǎn)物為HA1基因。最后，由于linker-1與linker-2可以堿基互補，所以通過橋式PCR反應(yīng)將pgsA基因與HA1基因融合在一起，進而獲得pgsA-HA1基因。pgsA-HA1基因與表達質(zhì)粒pNZ8110分別經(jīng)Spe I/Hind III酶切后進行連接，連接后的產(chǎn)物命名為：pNZ8110-pgsA-HA1。 將上述表達載體pNZ8150-HA、pNZ8110-HA和pNZ8110-pgsA-HA1分別電轉(zhuǎn)至感受態(tài)細菌Lactococcus lactis NZ9000（L.lactis NZ9000），篩選到的陽性克隆分別命名為： L.lactis(pNZ8150-HA)、 L.lactis(pNZ8110-HA)和L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)。作為陰性對照，將不帶外源基因的表達質(zhì)粒pNZ8110也電轉(zhuǎn)至感受態(tài)細菌L.lactis NZ9000中，命名為L.lactis(pNZ8110)。 通過nisinA對不同表達類型的重組乳酸乳球菌進行誘導(dǎo)表達，其最優(yōu)化的誘導(dǎo)表達條件是：nisinA的終濃度為1ng/ml，誘導(dǎo)時間為3小時。 為了檢測外源蛋白在乳酸乳球菌的表達定位，我們通過western blot對nisinA誘導(dǎo)后的L.lactis(pNZ8110)、L.lactis(pNZ8150-HA)、L.lactis(pNZ8110-HA)和L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)的上清和細菌沉淀裂解物進行了分析。Westernblot結(jié)果顯示，L.lactis(pNZ8110)在上清和細菌沉淀的裂解物中沒有出現(xiàn)特異性的HA蛋白條帶，說明含空白質(zhì)粒的乳酸乳球菌經(jīng)nisinA誘導(dǎo)后并沒有產(chǎn)生特異性的HA蛋白（約64kDa）。在L.lactis(pNZ8150-HA)的上清中沒有檢測到特異性條帶，但在細菌沉淀裂解物中檢測到了一條約64kDa的特異性條帶，說明L.lactis(pNZ8150-HA)是一種非分泌型的重組乳酸乳球菌。L.lactis(pNZ8110-HA)在上清和細菌裂解物中均出現(xiàn)了HA特異性的條帶（約64kDa），說明L.lactis(pNZ8110-HA)是分泌型的重組乳酸乳球菌。而L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)只在細菌沉淀的裂解物中發(fā)現(xiàn)有特異性的條帶，分子量在82kDa左右（PgsA蛋白約44kDa，HA1蛋白約38kDa），在上清中并未檢測到特異性條帶。但是要確定L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)是表面展示型重組乳酸乳球菌還需要進一步的實驗論證。通過多克隆抗-HA血清對不同表達類型的重組乳酸乳球菌的表面進行處理，經(jīng)流式細胞儀與熒光顯微鏡分析，結(jié)果顯示L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)呈陽性，說明其表面有特異性的抗原蛋白存在，而L.lactis(pNZ8110)、L.lactis(pNZ8150-HA)與L.lactis(pNZ8110-HA)均為陰性。通過western blot、流式細胞儀以及免疫熒光分析，毫無爭議地證實了，三種不同表達類型的重組乳酸乳球菌獲得了正確構(gòu)建，并且經(jīng)nisinA誘導(dǎo)表達后，外源蛋白準確地定位表達在乳酸乳球菌的不同部位。此外，通過Brodfford法對nisinA誘導(dǎo)前、后的L.lactis(pNZ8150-HA)、 L.lactis(pNZ8110-HA)以及L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)的總蛋白濃度進行了測定，表達的外源蛋白濃度分別為：1.4813mg/ml、5.7144mg/ml和5.2288mg/ml。 為了摸索出最佳的免疫劑量并考察佐劑對免疫效果的影響，我們采用的免疫策略是，免疫時間：1～3天、14～16天、28～30天（共免疫9次）。考察用的免疫劑量分別為：50ul、100ul、150ul、200ul，（重組乳酸乳球菌的濃度為：1011CFU/ml）。當(dāng)聯(lián)合佐劑使用時，每次加入的佐劑量為1mg霍亂毒素B亞單位（CTB）。以相同劑量的PBS、 L.lactis(pNZ8110)、 PBS+CTB以及L.lactis(pNZ8110)＋CTB作為對照組。每個劑量組的小鼠數(shù)量為10只。 通過ELISA檢測HA特異性的血清IgG抗體和糞便IgA抗體，進而獲得最優(yōu)化的免疫劑量。通過比較四個不同劑量組的IgG和IgA水平，最優(yōu)的免疫劑量組合是：(150ul重組乳酸乳球菌＋1mg CTB)/次，其中，L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)＋CTB組的免疫效果最好，L.lactis(pNZ8110-HA)＋CTB組其次，而L.lactis(pNZ8150-HA)＋CTB組免疫效果最差。進一步地，從ELISpot分析、血凝抑制實驗和病毒攻擊實驗三個方面重點探討了小鼠經(jīng)這個最優(yōu)劑量組合免疫后的效果，其中小鼠經(jīng)L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)＋CTB或L.lactis(pNZ8110-HA)＋CTB免疫后不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的體液免疫與黏膜免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答。經(jīng)H5N1病毒進行致死性攻擊后，L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)＋CTB組的小鼠獲得了完全保護，100％存活，L.lactis(pNZ8110-HA)＋CTB組的小鼠存活率為80％。這說明我們開發(fā)出來的這兩種疫苗（表面展示型與分泌型重組乳酸乳球菌）在結(jié)合佐劑CTB使用后能提供有效的免疫保護。 盡管黏膜免疫佐劑CTB的使用提高了重組乳酸乳球菌，尤其是表面展示型與分泌型重組乳酸乳球菌的免疫效率，但是每次較高的免疫劑量（150ul，重組乳酸乳球菌的濃度為：1011CFU/ml）、較多的免疫次數(shù)以及CTB的潛在危險促使我們找尋另外一個更安全、有效和可行的方法。我們試圖希望用更少的免疫劑量和免疫次數(shù)而獲得更好的免疫效果。根據(jù)重組乳酸乳球菌作為黏膜免疫輸送載體的特點，大部分的重組乳酸乳球菌經(jīng)口服免疫后在胃部就被強酸降解了，進入小腸部位的活菌很少，而能被小腸絨毛M細胞攝取的活菌就更少了。鑒于此，我們設(shè)計了這樣一個實驗，將重組乳酸乳球菌經(jīng)腸溶膠囊包裹后免疫小鼠，這樣既逃避了胃酸的降解，又可將重組乳酸乳球菌靶向到小腸部位，從而提高重組乳酸乳球菌的免疫效率。 為了敘述的方便，我們將L.lactis(pNZ8110)、L.lactis(pNZ8150-HA)、L.lactis(pNZ8110-HA)以及L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)分別命名為L1、L2、L3和L4，它們經(jīng)腸溶膠囊包裹后依次命名為：capsule-L1、capsule-L2、capsule-L3和capsule-L4。具體的免疫策略是，免疫時間為：0、2、4、6周（每隔一周免疫1次，共4次），腸溶膠囊包裹劑量為：10ul（重組乳酸乳球菌的濃度為：1011CFU/ml），免疫劑量為：1粒膠囊/次。為了更好地體現(xiàn)腸溶膠囊的優(yōu)勢，以相同劑量的PBS、L1、L2、L3和L4作為參考，其中PBS、L1與capsule-L1作為陰性對照組，每個劑量組10只小鼠。 通過ELISA檢測各免疫組的HA特異性的血清IgG和糞便IgA，，其中capsule-L3組與capsule-L4組的抗體水平明顯高于其它免疫組，通過ELISpot檢測IFN-γ的分泌水平，capsule-L3組與capsule-L4組也同樣明顯高于其它組。這表明，小鼠經(jīng)capsule-L3或capsule-L4免疫后不僅誘導(dǎo)了體液免疫應(yīng)答、黏膜免疫應(yīng)答，而且還誘導(dǎo)產(chǎn)生了細胞免疫應(yīng)答。血清的微量中和分析從另一個側(cè)面支持了capsule-L3與capsule-L4的免疫效果。通過同型H5N1病毒的致死性攻擊，capsule-L3與capsule-L4的小鼠獲得了完全保護，100％存活，而其它免疫組的小鼠存活率菌低于或等于40％。因此，我們開發(fā)出的capsule-L3與capsule-L4這兩種疫苗能提供很強的免疫保護功能，為防治高致病性禽流感H5N1病毒的感染提供了一個新的、可行的思路。 綜上所述，我們成功地構(gòu)建了三種不同表達類型的重組乳酸乳球菌，經(jīng)nisinA誘導(dǎo)表達后，HA或HA1抗原蛋白準確地定位表達在乳酸乳球菌的不同部位，分泌型重組乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-HA)和表面展示型重組乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)分別聯(lián)合黏膜免疫佐劑CTB使用后獲得了最佳的免疫效果，說明我們開發(fā)的這兩種重組乳酸乳球菌疫苗可以用于防治高致病性禽流感H5N1病毒的感染。另外， L.lactis(pNZ8110-HA)和L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)分別被腸溶膠囊包裹后（即capsule-L3和capsule-L4），小鼠經(jīng)capsule-L3或capsule-L4免疫后獲得完全保護。這些結(jié)果顯示，capsule-L3和capsule-L4這兩種疫苗在預(yù)防高致病性禽流感H5N1病毒方面具有更大的潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【共引文獻】

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