【摘要】： 目的:雜色曲霉素(sterigmatocystin, ST)是致癌性的真菌毒素,是雜色曲霉(Aspergillus versicolor)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)等真菌產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物。在糧食和飼料中的污染非常普遍,甚至在潮濕居所的地毯灰塵中也可檢出雜色曲霉素的污染。研究表明,在我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中ST也是主要污染霉菌毒素之一。 眾所周知,惡性腫瘤的發(fā)生除致癌物的直接作用外,機(jī)體的免疫狀態(tài)也發(fā)揮著非常重要的作用。近年來(lái),一些真菌毒素對(duì)人或動(dòng)物的免疫機(jī)能,特別是對(duì)細(xì)胞因子分泌和表達(dá)的影響引起了學(xué)術(shù)界的關(guān)注。由于細(xì)胞因子在免疫細(xì)胞間充當(dāng)信號(hào)聯(lián)絡(luò)作用,是免疫細(xì)胞在功能上相互聯(lián)絡(luò)的"語(yǔ)言"之一。通過(guò)這種"語(yǔ)言",整個(gè)免疫系統(tǒng)才能協(xié)調(diào)一致。因此,研究外周血單個(gè)核細(xì)胞及腹腔巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的作用是揭示免疫應(yīng)答本質(zhì)的一種重要手段。 目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)ST的研究多側(cè)重于產(chǎn)毒的分子機(jī)制、污染現(xiàn)狀和致癌性研究方面,而有關(guān)ST對(duì)機(jī)體免疫機(jī)能影響的研究較少。本研究組既往對(duì)ST的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了一系列的研究,研究結(jié)果表明ST可以抑制體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12的表達(dá)與分泌;可以誘導(dǎo)或抑制小鼠脾細(xì)胞IL-2、IFN-γ和IL-4的表達(dá)與分泌;并且ST還可以對(duì)體外培養(yǎng)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(human peripheral bloodmononuclear cells, HPBMc)培養(yǎng)上清中IL-2的分泌有一定抑制作用,提示ST對(duì)機(jī)體的免疫功能具有一定的影響。但是,上述研究均為體外分離培養(yǎng)免疫細(xì)胞進(jìn)行的研究,從動(dòng)物整體水平上的研究尚很少。因此,本研究采用半定量RT-PCR方法探討了腹腔注射ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-6和IL-12在mRNA水平的影響,并用ELISA方法研究ST對(duì)小鼠血清中TNF-α及IL-6含量的影響,旨在從免疫角度探討我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)糧食中常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)污染霉菌毒素-ST對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的可能影響,揭示ST的暴露在我國(guó)食管癌高發(fā)區(qū)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用。 方法: 1實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物處理 選用健康雄性BALB/c小鼠96只,隨機(jī)分為3組,分別為ST處理組、溶劑對(duì)照組和對(duì)照組。按照處死時(shí)間的不同,又將上述各組分為2h、6h、12h和24h四組。各ST處理組小鼠均經(jīng)腹腔單次注射ST 3000μg/kg,溶劑對(duì)照組和對(duì)照組動(dòng)物分別腹腔注射同等容量的溶劑(DMSO生理鹽水溶液)和生理鹽水。 2小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 小鼠摘眼球取血,用3.2%檸檬酸三鈉(Na_3C_8H_5O_7.2H_2O)抗凝,采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞。 3小鼠血清的制備 小鼠摘眼球取血,待血凝固后離心取上清,-80℃保存?zhèn)溆谩?4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離 將小鼠眼球放血處死后,浸泡于75%酒精,用10 ml冰冷的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗腹腔,無(wú)菌收集腹腔滲出細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞后,按5×106cells/mL接種于含105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,37℃、5% CO_2培養(yǎng)2小時(shí)以使巨噬細(xì)胞貼壁。 5細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量 采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。1%瓊脂糖電泳鑒定其完整性。紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。 6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 檢測(cè)ST在不同處理時(shí)間對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞及腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-12 mRNA表達(dá)的影響。采用凝膠分析軟件(BIO-LD)對(duì)凝膠進(jìn)行定量,各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH量的比值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。 7 ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子的水平 采用晶美生物工程(北京)有限公司的小鼠TNF-α、IL-6定量試劑盒,檢測(cè)ST處理不同時(shí)間對(duì)小鼠外周血中TNF-α和IL-6水平的影響。 8統(tǒng)計(jì) 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析與單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA),數(shù)據(jù)用x±s表示。 結(jié)果: 一ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-12 mRNA表達(dá)的影響 1 ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)的影響 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳及定量分析表明,與生理鹽水對(duì)照組相比,各溶劑對(duì)照組小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯不同。ST 2h、6h、12h和24h處理組TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.28±0.04,0.16±0.04,0.21±0.06和0.22±0.05,均明顯低于其對(duì)應(yīng)的溶劑對(duì)照組(0.38±0.03,0.41±0.03,0.42±0.05和0.37±0.06,P0.01),其中以ST 6h處理組TNF-αmRNA的表達(dá)降低最明顯(P0.05)。 2 ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響 半定量RT-PCR檢測(cè)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6 mRNA水平的結(jié)果表明,IL-6 mRNA的表達(dá)在各生理鹽水對(duì)照組與溶劑對(duì)照組細(xì)胞之間無(wú)明顯差異。而ST處理組與其相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較IL-6 mRNA的表達(dá)均有一定差異,隨ST處理時(shí)間不同對(duì)IL-6 mRNA的表達(dá)影響也不同。ST 2h、6h處理組IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.75±0.09,1.38±0.20)均高于溶劑對(duì)照組(0.54±0.13,0.48±0.08,P0.01)。但ST 12h、24h處理組表達(dá)呈降低趨勢(shì),ST 24h處理組的相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.05,明顯低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組(0.55±0.09,P0.01)。 3 ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-12 mRNA表達(dá)的影響 與生理鹽水對(duì)照組相比,各溶劑對(duì)照組細(xì)胞IL-12p35 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯不同。ST 2h、6h、12h和24h處理組IL-12p35 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.33±0.06,0.29±0.07,0.30±0.04和0.35±0.05,均明顯低于相應(yīng)溶劑對(duì)照組(0.66±0.10,0.69±0.13,0.71±0.05,0.73±0.16,P0.01)。但在ST處理組之間其表達(dá)無(wú)明顯改變。 在空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、ST處理組均未檢測(cè)到小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-12p40 mRNA的表達(dá)。 二ST對(duì)小鼠外周血血清中TNF-α和IL-6水平的影響 1 ST對(duì)小鼠血清中TNF-α水平的影響 ELISA檢測(cè)小鼠血清中TNF-α水平的結(jié)果表明,ST2h、6h、12h、24h處理組與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組的TNF-α水平{(11.43±0.60)、(12.17±1.04)、(11.69±1.53)、(12.43±1.40)pg/ml}相比,TNF-α水平均明顯降低(P0.01)。ST 2h和6h處理組TNF-α血清水平分別為(9.14±0.58)pg/ml和(8.57±0.57)pg/ml,而在ST 12h和24h處理組均未檢測(cè)到TNF-α。ST處理組小鼠血清中TNF-α水平,隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,二者呈負(fù)相關(guān)(r = -0.905, P0.01)。 2 ST對(duì)小鼠血清中IL-6水平的影響 ELISA檢測(cè)小鼠血清中IL-6水平的結(jié)果表明,ST2h、6h、12h、24h處理組與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組{(10.63±1.58)、(11.63±1.52)、(12.25±1.26)、(10.90±1.14)pg/ml}相比,IL-6水平均明顯降低(P0.01)。在ST 2h和6h處理組IL-6的水平分別為(7.32±1.10) pg/ml和(7.00±1.00) pg/ml,ST12h和24h處理組均未檢測(cè)到IL-6蛋白的分泌。ST處理組小鼠血清中IL-6水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(r = -0.933,P0.01)。 三ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6及IL-12 mRNA表達(dá)的影響 1 ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)的影響 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳及定量分析表明,各溶劑對(duì)照組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)與生理鹽水對(duì)照組相比無(wú)差異。ST 2h、6h、12h、24h處理組TNF-αmRNA的相對(duì)表達(dá)量依次為0.37±0.08,0.34±0.06,0.15±0.01 , 0.13±0.03 ,均明顯低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組(0.51±0.06,0.52±0.04,0.54±0.10,0.53±0.10,P0.05)。ST處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低(r = -0.833, P0.01)。 2 ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響 與生理鹽水對(duì)照組相比,各溶劑對(duì)照組細(xì)胞IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯改變。不同時(shí)間ST處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均比相應(yīng)的溶劑對(duì)照組顯著降低(P 0.01),但各ST處理組間IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3 ST對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12 mRNA表達(dá)的影響 IL-12p35 mRNA相對(duì)表達(dá)量在溶劑對(duì)照組與生理鹽水對(duì)照組之間沒(méi)有明顯變化。各ST處理組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12p35 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均較其相應(yīng)的溶劑對(duì)照組顯著降低。 在空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、ST處理組均未檢測(cè)到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-12p40 mRNA的表達(dá)。 結(jié)論: 1單次給予小鼠腹腔注射ST 3000ug/kg后,在2-24h范圍內(nèi)ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)主要為抑制作用,其中以6h處理組的抑制最為顯著。 2 ST對(duì)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響隨處理時(shí)間的不同而不同,在處理2h和6h,ST對(duì)IL-6 mRNA的表達(dá)具有一定的誘導(dǎo)作用,而隨著ST處理時(shí)間延長(zhǎng)至24h,表現(xiàn)為明顯的抑制作用。 3 ST可以顯著抑制小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-12p35 mRNA表達(dá)。 4 ST可以降低小鼠外周血血清中TNF-α及IL-6的水平,且作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。 5 ST處理可以抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6及IL-12p35 mRNA的表達(dá),其中ST對(duì)TNF-αmRNA的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)。 6本研究結(jié)果提示,ST除其致癌性外,ST還可能通過(guò)細(xì)胞因子的改變對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392;R735.1

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9 陳華標(biāo);SARS冠狀病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 李向東;外周血單個(gè)核細(xì)胞MHC基因表達(dá)與早期急性移植排斥的研究[D];山東大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張穎;雜色曲霉素對(duì)小鼠免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2008年

2 劉晉紅;單次灌胃雜色曲霉素對(duì)小鼠大腦細(xì)胞影響的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2003年

3 萬(wàn)曉偉;雜色曲霉素對(duì)體外培養(yǎng)人胃粘膜上皮細(xì)胞HLA-1分子表達(dá)的影響及其機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

4 崔瑜;ATM-Chk2信號(hào)通路對(duì)雜色曲霉素誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞G_2期阻滯的相關(guān)因子影響的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

5 張蓉;當(dāng)歸多糖對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和功能的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

6 張莉;SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CD43基因的表達(dá)[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2005年

7 熊斌;吸煙對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞及其表達(dá)煙堿乙酰膽堿受體的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 李華;系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹�(gè)核細(xì)胞凋亡情況及其相關(guān)基因表達(dá)的研究[D];青島大學(xué);2005年

9 吳維;體外誘導(dǎo)成人外周血單個(gè)核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2007年

10 尚華;體外誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2336268