【摘要】：目的運(yùn)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)重組EV71、CA16病毒樣顆粒（Virus-like particle，VLP），對重組EV71、CA16雙價VLP疫苗的免疫原性及免疫保護(hù)性進(jìn)行評價，為發(fā)展安全、有效、具有保護(hù)作用的手足口病新型疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法（1）通過測序分別獲得構(gòu)建EV71、CA16VLP所必需的疫苗候選株基因P1、3CD片段序列，首先根據(jù)昆蟲密碼子偏愛性選擇優(yōu)勢密碼子，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對EV71、CA16P1和3CD基因進(jìn)行設(shè)計和全基因合成。將合成后的P1、3CD序列構(gòu)建到穿梭質(zhì)粒pFastBacDual上，通過位點特異性重組篩選陽性重組菌DH10BacTME.coli，將EV71、CA16的重組桿粒Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9獲得重組桿狀病毒；通過透射電鏡、間接免疫熒光、SDS-PAGE、Western blot對純化的重組EV71、CA16VLP蛋白抗原進(jìn)行鑒定。（2）將純化后的重組目的蛋白，聯(lián)合使用Al(OH)3佐劑，采用腹腔注射的途徑免疫4-6周齡ICR小鼠，于0d、14d對小鼠進(jìn)行兩次免疫，一免10d和二免10d后采集小鼠尾靜脈血，二免14d后取小鼠脾臟。通過間接ELISA法檢測血清IgG抗體效價、血清抗體亞型分布及ELISPOT等方法比較重組EV71、CA16單價及雙價VLP疫苗免疫原性；通過體外微量中和試驗比較重組EV71、CA16單價及雙價VLP疫苗對現(xiàn)有EV71、CA16流行株的保護(hù)作用；將EV71、CA16單價及雙價VLP疫苗免疫ICR乳母鼠，用EV71、CA16強(qiáng)毒株攻擊其新生5日齡乳鼠，觀察乳鼠體重變化及存活率，，綜合比較重組EV71、CA16單價及雙價VLP疫苗的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果（1）經(jīng)SDS-PAGE、Western blot以及間接免疫熒光試驗結(jié)果均證明了EV71、CA16VLP的表達(dá)，透射電鏡觀察可見直徑大小約為23～30nm的EV71、CA16VLP，與完整的病毒顆粒結(jié)構(gòu)一致，通過蔗糖密度梯度離心純化，獲得了純度在90%以上的EV71、CA16VLP抗原；（2）動物實驗比較重組EV71、CA16VLP單價、雙價疫苗的免疫原性。間接ELISA法顯示重組EV71、CA16單價、雙價VLP疫苗組與PBS對照組抗體水平差異顯著（p0.05），且雙價組顯著高于單價組（p0.05）。中和抗體效價測定顯示雙價組中和抗體效價高于單價組（p0.05）。小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ和IL-4分泌細(xì)胞水平檢測顯示重組EV71、CA16VLP疫苗各組均可以檢測到一定水平的IFN-γ和相對較低水平的IL-4，且雙價疫苗組高于單價組。應(yīng)用EV71-BJ、CA16-TS強(qiáng)毒株分別攻毒，證實重組EV71、CA16單價、雙價VLP疫苗均能有效保護(hù)5日齡ICR乳鼠抵抗致死劑量病毒的攻擊，且雙價VLP疫苗保護(hù)效果優(yōu)于單價VLP疫苗。 結(jié)論通過昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建、表達(dá)和純化EV71、CA16VLP，純度可達(dá)90%以上。研制的重組V71、CA16雙價VLP疫苗具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。昆蟲桿狀系統(tǒng)表達(dá)的重組EV71、CA16雙價VLP疫苗具有較好免疫原性及免疫保護(hù)效果，是值得深入研究的手足口病候選疫苗。
[Abstract]:Objective to construct and express recombinant EV71,CA16 virus-like particles (Virus-like particle,VLP) by using Bac-to-Bac baculovirus expression system to evaluate the immunogenicity and immunogenicity of recombinant EV71,CA16 bivalent VLP vaccine. A new vaccine for HFMD with protective effect is established. Methods (1) the sequence of P1m3CD fragment of vaccine candidate gene necessary for EV71,CA16VLP construction was obtained by sequencing. Firstly, the dominant codon was selected according to insect codon preference, and EV71, was analyzed by molecular biology technique. CA16P1 and 3CD genes were designed and synthesized. The synthesized p1h3CD sequence was constructed into shuttle plasmid pFastBacDual, and the recombinant baculovirus was obtained by site-specific recombinant screening of positive recombinant strain DH10BacTME.coli, and transfection of the recombinant Bacmid of EV71,CA16 into insect cell Sf9. The purified recombinant EV71,CA16VLP protein antigen was identified by transmission electron microscopy indirect immunofluorescence and SDS-PAGE,Western blot. (2) the purified recombinant target protein was combined with Al (OH) 3 adjuvant. ICR mice aged 4-6 weeks were immunized by intraperitoneal injection. The mice were immunized twice on day 14. The caudal vein blood was collected after 10 days and 10 days, and the spleen was taken after 14 days. The immunogenicity of recombinant EV71,CA16 monovalent and bivalent VLP vaccine was compared by indirect ELISA assay, serum IgG antibody titer, distribution of serum antibody subtypes and ELISPOT. To compare the protective effect of recombinant EV71,CA16 monovalent and bivalent VLP vaccine on existing EV71,CA16 epidemic strains by in vitro microneutralization test. EV71,CA16 monovalent and bivalent VLP vaccines were used to immunize ICR lactating female mice. The neonatal 5-day-old mice were attacked with EV71,CA16 virulent strain to observe the body weight change and survival rate, and to compare the immune protective effect of recombinant EV71,CA16 monovalent and bivalent VLP vaccine. Results (1) the expression of EV71,CA16VLP was confirmed by SDS-PAGE,Western blot and indirect immunofluorescence assay. The structure of EV71,CA16VLP, with a diameter of about 23~30nm was the same as that of intact virus particles observed by transmission electron microscope. Purified by sucrose density gradient centrifugation, the EV71,CA16VLP antigen with purity above 90% was obtained. (2) the immunogenicity of recombinant EV71,CA16VLP monovalent and bivalent vaccine was compared in animal experiments. Indirect ELISA assay showed that there was significant difference in antibody level between the bivalent VLP vaccine group and the PBS control group (p0.05), and the level of antibody in the bivalent group was significantly higher than that in the univalent group (p0.05). Neutralization antibody titer test showed that neutralization antibody titer in bivalent group was higher than that in univalent group (p0.05). The levels of IFN- 緯 and IL-4 secreting cells in spleen lymphocytes of mice showed that the recombinant EV71,CA16VLP vaccine could detect a certain level of IFN- 緯 and a relatively low level of IL-4, in each group, and the bivalent vaccine group was higher than the univalent group. Using EV71-BJ,CA16-TS virulent strain to attack the virus separately, it was proved that the recombinant EV71,CA16 monovalent and bivalent VLP vaccine could effectively protect the 5-day-old ICR neonatal mice from lethal dose virus attack, and the bivalent VLP vaccine was better than the univalent VLP vaccine. Conclusion the purity of EV71,CA16VLP, expressed and purified by insect baculovirus expression system was over 90%. The recombinant V71 CA16 bivalent VLP vaccine has good immunogenicity and can stimulate humoral and cellular immune responses. The recombinant EV71,CA16 bivalent VLP vaccine expressed by insect rod system has good immunogenicity and immuno-protective effect. It is a candidate vaccine for HFMD.
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

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6 迮文遠(yuǎn);論疫苗接種副反應(yīng)[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2003年01期

7 呂景佳,陳若荔,李奕雁;泉州市區(qū)有價疫苗使用現(xiàn)狀及控制對策[J];中國公共衛(wèi)生管理;2003年03期

8 王飛,賀蓓;兒童時期多抗原疫苗接種不會增加免疫外感染的危險性[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2005年35期

9 Smith P.J.;Chu S.Y.;Barker L.E.;王經(jīng)緯;;對沒有接種疫苗兒童的調(diào)查[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(兒科學(xué)分冊);2005年07期

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3 楊錫強(qiáng);;疫苗接種的不良反應(yīng)及其處理[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2010年

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5 唐秋艷;林興兵;劉麗;史楠;曹友聲;;疫苗發(fā)展現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會協(xié)調(diào)發(fā)展——河南省第四屆青年學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2004年

6 劉柏林;熊亞軍;唐有智;唐孝富;;合川區(qū)適齡兒童卡介疫苗接種成功率調(diào)查分析[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會2012年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年

7 李明娟;王曉霞;;疫苗報道的困境與出路研究[A];2012年度中國健康傳播大會優(yōu)秀論文集[C];2012年

8 李鑫;滕繼軍;王軍紅;張晨;;疫苗接種后面部變異型吉蘭-巴雷綜合征1例報道[A];山東省2013年神經(jīng)內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國神經(jīng)免疫大會2013論文匯編[C];2013年

9 陳賢希;陳波;;疫苗藥品管理與應(yīng)用存在的問題及對策[A];2013年中國藥學(xué)會藥事管理專業(yè)委員會年會暨“醫(yī)藥安全與科學(xué)發(fā)展”學(xué)術(shù)論壇論文集（下冊）[C];2013年

10 熊仲祥;;“金苗通”:關(guān)注下一代從零開始[A];信息讓生活更美好——江蘇省通信行業(yè)信息化案例選編[C];2010年

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3 ;現(xiàn)在,最稀缺的仍是真相[N];第一財經(jīng)日報;2010年

4 本報記者 趙玲;理性看待疫苗風(fēng)險[N];中國醫(yī)藥報;2010年

5 舒圣祥;請“創(chuàng)造條件”讓公眾監(jiān)督疫苗亂象[N];檢察日報;2010年

6 記者李紅;世界疫苗接種投資嚴(yán)重不足[N];科技日報;2002年

7 李丹;我國疫苗產(chǎn)業(yè)成長空間廣闊[N];科技日報;2010年

8 本報記者;通報山西“貼簽疫苗”有關(guān)情況[N];山西日報;2010年

9 玉溪市動物疫病預(yù)防控制中心 歐陽仙;禽類疫苗免疫注意事項[N];云南科技報;2011年

10 本報記者 戴岱;疫苗接種 家長要有“安全弦”[N];中國消費(fèi)者報;2013年

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1 邢泉;靶向防齲DNA疫苗增強(qiáng)粘膜免疫的分子機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2010年

2 赫兢;治療性乙型肝炎病毒DNA疫苗的基礎(chǔ)研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

3 許瑾;河北省正定縣農(nóng)村居民對菌痢疫苗接受性及影響因素研究[D];復(fù)旦大學(xué);2005年

4 王敏慧;異型M-CSF/M-CSFR DNA疫苗構(gòu)建及其免疫效應(yīng)的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

5 邱志華;病毒樣顆粒構(gòu)建和治療性降壓疫苗的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

6 趙振林;T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)移植免疫耐受的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2003年

7 朱中元;結(jié)核DNA疫苗的構(gòu)建、免疫功能及保護(hù)效果研究[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

8 萬家余;甲、乙型肝炎口服二價DNA疫苗的研究[D];吉林大學(xué);2005年

9 尹遵棟;部分地區(qū)成人流行性乙型腦炎流行病學(xué)特征及疫苗接種的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評價[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2011年

10 傅傳喜;S_(79)株腮腺炎減毒活疫苗人群免疫保護(hù)效果研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

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1 黃令;疫苗價值的經(jīng)濟(jì)學(xué)研究[D];上海社會科學(xué)院;2010年

2 侯永娟;學(xué)齡前流動兒童疫苗接種調(diào)查與分析[D];首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué);2012年

3 董鐸;我國疫苗不良事件監(jiān)測體系研究[D];沈陽藥科大學(xué);2007年

4 陳宇斌;疫苗接種管理系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)[D];廈門大學(xué);2014年

5 魏茂提;疫苗聯(lián)合接種的安全性和有效性實驗研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

6 李亮;湖南省四縣農(nóng)村人群狂犬病暴露率及疫苗接種影響因素研究[D];中南大學(xué);2012年

7 錢小慧;全過程視角的疫苗安全影響因素分析[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2013年

8 吳小麗;中試生產(chǎn)防齲DNA疫苗、結(jié)核DNA疫苗效力評價試驗[D];武漢生物制品研究所;2010年

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本文編號：2331964