【摘要】： 目的 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層,具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入和自我復(fù)制等特點(diǎn)的一類(lèi)細(xì)胞,在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下,可分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪、內(nèi)皮等多種表型組織細(xì)胞,傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能,可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。MSCs多取材于骨髓,屬侵襲性取材,制約其應(yīng)用于臨床。臍帶血(umbilical cord blood, UCB)是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤(pán)和臍帶中的血液,含有豐富的干細(xì)胞,臨床常采集臍帶血中造血干細(xì)胞用于治療血液類(lèi)疾病。最近幾年來(lái)有研究表明,臍帶血中也存在MSCs[2]。由于臍帶血來(lái)源豐富,采集方便,排斥小,無(wú)倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn),臍血來(lái)源MSCs作為移植用細(xì)胞越來(lái)越受到重視。 臍帶血MSCs缺少特異性表面標(biāo)志物,此類(lèi)細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90和HLA-ABC, CD 105和CD106,不表達(dá)CD14、CD34、CD45、CD133和HLA-DR,并可分化為成骨、軟骨、成脂和成肌樣細(xì)胞。有學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)單管多色染色技術(shù)分析臍帶血內(nèi)MSCs的數(shù)量,每百萬(wàn)個(gè)有核細(xì)胞當(dāng)中含有8.8±4.3個(gè)MSCs細(xì)胞,而骨髓樣本當(dāng)中每百萬(wàn)個(gè)有核細(xì)胞當(dāng)中含有13.2±5.8個(gè)MSC細(xì)胞。分析了臍血MSCs表面抗原表達(dá)情況,建立了應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)單管多色染色分析臍帶血內(nèi)MSCs數(shù)量的方法。有報(bào)道說(shuō)臍帶血中MSCs數(shù)量變化較大.臍帶血中MSCs的數(shù)量能有多少,隨著胎兒成熟,其數(shù)量是否發(fā)生變化,]MSCs體外培養(yǎng)其生長(zhǎng)速度如何,培養(yǎng)的成功率如何,臍帶血中MSCs在胎兒發(fā)育中是扮演了什么樣的角色,發(fā)揮了怎樣的作用都是值得探討的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用單管多色熒光染色技術(shù)分析了不同胎齡臍帶血中CD44、CD105陽(yáng)性而CD34、CD45陰性細(xì)胞的數(shù)量,以比較不同胎齡臍帶血中MSCs數(shù)量的差別,并分析臍帶血成功培養(yǎng)出MSCs的影響因素,比較不同胎齡臍帶血獲得的MSCs的生長(zhǎng)特性,為進(jìn)一步探討臍帶血MSCs生物學(xué)特性打下基礎(chǔ)。 方法 1、單管多色染色行流式細(xì)胞學(xué)分析臍帶血中MSCs的數(shù)量 (1)無(wú)菌條件下取正常臍帶血52份,胎齡從28周～42周,產(chǎn)婦及胎兒無(wú)血液系統(tǒng)疾病及其他影響造血功能的病變, (2)每份各取適量血進(jìn)行單管多色染色行流式細(xì)胞學(xué)分析, (3)比較不同胎齡臍帶血中MSCs的數(shù)量。 2、培養(yǎng) (1)無(wú)菌條件下取37周～40周臍帶血12份,28周～36周臍帶血12例,用含抗凝保護(hù)液的采血袋抽取,分別作為足月組和非足月組。 (2)每組各例分別取適量血進(jìn)行單管多色染色行流式細(xì)胞學(xué)分析 (3)將臍血稀釋后,直接用Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞,采用含10%血清濃度的L-DMEM常規(guī)間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)； (4)對(duì)貼壁細(xì)胞類(lèi)型、生長(zhǎng)速度進(jìn)行觀察記錄； (5)對(duì)各組成功培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞的例數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析； (6)對(duì)分離出的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 1、流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果：52例臍帶血中CD44(+)、CD105(+)/CD34(-)、CD45(-)細(xì)胞在10例28周～30周臍帶血中的數(shù)量為15±0.2個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞；在12例31周～33周臍帶血中為11±0.3個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞；在10例34周～36周臍帶血中為10±0.1個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞；在10例37周～39周臍帶血中為6±0.5個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞；在10例40周～42周臍帶血中,為2±0.3個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞�？梢�(jiàn)隨胎齡增加,檢測(cè)到的MSC數(shù)量減少。 在用來(lái)培養(yǎng)的臍帶血足月組中CD44(+)、CD105(+),而CD34(-)、CD45(-)的細(xì)胞數(shù)量為6.2±0.2個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞,非足月組為10.3±0.2個(gè)／百萬(wàn)有核細(xì)胞,兩組間存在顯著性差異(P0.01)。 2、足月組與非足月組間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)特性比較 足月組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后貼壁細(xì)胞均出現(xiàn)梭形纖維狀的細(xì)胞和圓形細(xì)胞兩種形態(tài)細(xì)胞,傳代后有1／12份臍血出現(xiàn)旋渦狀排列的間充質(zhì)樣的細(xì)胞,其余11／12份傳代后只有少量梭形細(xì)胞混雜,胰酶難以消化下來(lái),最終老化死亡。非足月組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后,貼壁細(xì)胞多為纖維狀的間充質(zhì)樣細(xì)胞,傳代后3／12份臍帶血分離出了間充質(zhì)樣梭形細(xì)胞,且生長(zhǎng)速度明顯快于足月組。 3、臍血分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞成功率 足月組分離培養(yǎng)間充質(zhì)千細(xì)胞總的成功率為8.3%,非足月組為25.0%。 4、對(duì)分離出的臍血MSCs進(jìn)行鑒定 兩組培養(yǎng)所獲得梭形細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)MSCs標(biāo)志物表達(dá)：CD45(-),CD90(+)。 結(jié)論 1、臍帶血中含有MSCs,隨胎齡增加數(shù)量減少； 2、非足月產(chǎn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞接種成功率高于足月產(chǎn)臍帶血的接種成功率； 3、非足月產(chǎn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)速度快于足月產(chǎn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)速度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2326932