【摘要】： 目的:短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)是一種腐生性條件致病真菌,通常引起甲真菌病,較少引起其他部位的感染,但目前國外已經(jīng)有關(guān)于深部組織感染的報道。此菌分離于我科門診病人,經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物研究所鑒定為Scopulariopsis brevicaulis。 本研究一方面通過對短帚霉形態(tài)學(xué)觀察,進(jìn)一步了解短帚霉的形態(tài)學(xué)特征與產(chǎn)孢方式,為臨床上診斷短帚霉病提供指導(dǎo);另一方面,通過動物實驗檢測其引起系統(tǒng)性感染的可能性,并且觀察不同免疫狀態(tài)下動物的死亡情況,同時對自然死亡和分期處死的小鼠進(jìn)行解剖,通過鏡檢、組織逆培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、組織載菌量測定等方法比較各臟器的感染程度。為進(jìn)一步了解此菌的致病力和引起的病理形態(tài)學(xué)改變提供實驗室依據(jù)。 方法: 1 DNA序列分析提取分離菌DNA,PCR擴(kuò)增其26SrDNA近5’端D1/D2區(qū)域,在DNA自動測序儀上進(jìn)行直接雙向測序確定堿基位點,通過GenBank/EMBL/DDBJ/PDB核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列檢索,通過系統(tǒng)樹顯示其親緣關(guān)系。 2菌株的形態(tài)學(xué)觀察 2.1大體菌落觀察將我科保存菌株復(fù)溫24h,轉(zhuǎn)種于SDA培養(yǎng)基上, 37℃和27℃溫箱培養(yǎng),每天觀察菌落的生長情況。 2.2光鏡觀察取其菌落標(biāo)本置于載玻片上,10%KOH溶液溶解后,蓋上蓋玻片,光鏡下觀察。 2.3掃描電鏡觀察取兩個溫度下培養(yǎng)10天的菌落標(biāo)本,置于4%的戊二醛中固定,常規(guī)制片后在掃描電鏡下觀察。 3動物的致病性試驗 3.1短帚霉系統(tǒng)感染動物模型的制作將保存菌株復(fù)溫,轉(zhuǎn)種于SDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)10天。用無菌生理鹽水制備成菌懸液,通過皮下、腹腔、靜脈三種途徑接種至不同免疫狀態(tài)的小鼠。 3.2死亡率的觀察連續(xù)觀察各組小鼠感染該菌后四周內(nèi)的自然死亡情況,記錄死亡日期和死亡只數(shù)。 3.3感染內(nèi)臟的大體觀察將不同感染時間的動物解剖,分別取出心、肝、脾、肺、腎,觀察各臟器是否腫大或萎縮、有無顏色變化等。 3.4直接鏡檢肉眼可見感染灶的臟器取膿灶處小塊組織,壓碎后于光學(xué)顯微鏡下直接鏡檢。 3.5組織逆培養(yǎng)各臟器用組織研磨器研碎后挑取少許分別接種于沙堡氏試管培養(yǎng)基,27℃溫箱培養(yǎng),觀察菌落的生長情況,然后挑取菌落制成濕片在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。 3.6組織病理學(xué)檢查取各臟器表面肉眼可見病理改變組織,用10%福爾馬林溶液常溫固定,常規(guī)脫水、透明、包埋、切片,HE和PAS染色,光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。 3.7腎臟載菌量(CFU)的測定單側(cè)腎臟用組織研磨器研碎后,加無菌生理鹽水1ml混勻,取10μl組織懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面,27℃溫箱中培養(yǎng),48小時后讀取平皿表面的菌落數(shù)。 結(jié)果: 1 DNA序列分析結(jié)果基于26SrDNA D1/D2區(qū)序列和Neighbor-Joining分析繪制的系統(tǒng)樹,示該菌株與Scopulariopsis brevicaulis是近緣種的關(guān)系。 2大體菌落觀察培養(yǎng)3～4天,菌落開始生長,初為白色膜樣菌落,生長迅速,以后變?yōu)榛液稚?3光鏡下觀察可見分枝分隔菌絲,帚狀枝,分生孢子自環(huán)孢子梗長出一串,呈球形,壁厚,表面光滑或粗糙。 4掃描電鏡觀察可見帚狀枝,菌絲末端或側(cè)面著生球形的分生孢子。 5動物模型腹腔和靜脈注射途徑感染小鼠,真菌培養(yǎng)陽性,組織病理學(xué)檢查可見大量菌絲和少數(shù)的孢子。皮下接種各臟器真菌培養(yǎng)和組織病理學(xué)改變均呈陰性。 6自然死亡情況免疫抑制靜脈組在接種后第2天開始出現(xiàn)死亡,第3天達(dá)到死亡高峰,死亡率高到93.3%。免疫抑制腹腔組在接種該菌后3天開始出現(xiàn)死亡,第7天達(dá)到高峰,至2周止,死亡率為53.3%。其余各組均無自然死亡。 7內(nèi)臟的大體改變見到肝脾腫大,或萎縮,呈紫紅色。部分死亡小鼠的肺明顯萎縮,呈粉色或白色。 8直接鏡檢可見大量分枝分隔菌絲,圓形孢子。 9組織逆培養(yǎng)三天后可見部分臟器長出菌落。 10病理學(xué)變化蘇木精-伊紅染色早期為急性炎細(xì)胞浸潤,可見組織細(xì)胞壞死,后期可見組織細(xì)胞及多核細(xì)胞反應(yīng)性增生。PAS染色可見紫紅色的菌絲和圓形孢子。 11腎臟載菌量(CFU)無論免疫正常還是免疫抑制狀態(tài)下,靜脈注射組腎臟感染程度較腹腔組重,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P0.05);免疫抑制腹腔注射組腎臟感染程度較免疫力正常腹腔注射組重,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P0.05);免疫抑制靜脈注射組腎臟感染程度較免疫力正常靜脈注射組重,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論: 1短帚霉只有絲狀型一種菌落形態(tài),可見豐富的分枝分隔菌絲,有帚狀枝,分生孢子由環(huán)孢子梗產(chǎn)生一串,呈球形,壁厚,表面光滑或粗糙有刺,為短帚霉的形態(tài)學(xué)特征。環(huán)痕產(chǎn)孢為其產(chǎn)孢方式。 2通過腹腔和靜脈注射途徑可以成功建立短帚霉系統(tǒng)性感染小鼠模型。皮下注射接種則不能致系統(tǒng)性感染。 3免疫力低下狀態(tài)更易引起感染,感染的程度也更重。但當(dāng)進(jìn)入體內(nèi)的菌量較大時也可引起免疫力正常的小鼠的系統(tǒng)性感染,說明此菌具有較強(qiáng)的致病力。 4短帚霉引起的組織病理學(xué)改變?yōu)檎婢腥镜募甭匝装Y,并無特異性改變。 5死亡率和腎臟組織載菌量顯示靜脈接種引起的感染程度較腹腔接種更嚴(yán)重。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R379;R756

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2325492