【摘要】： 研究目的: 剛地弓形蟲病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病。不僅對孕婦和新生兒構(gòu)成了極大的威脅,近年來又成為AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一�，F(xiàn)有的抗弓形蟲藥物幾乎都存在遠(yuǎn)期治療效果差、易復(fù)發(fā)、價(jià)格昂貴且對免疫功能缺陷患者基本無治療效果等諸多不足,開展新型抗弓形蟲藥物的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。藥物研究依賴于高效穩(wěn)定的弓形蟲體內(nèi)和體外培養(yǎng)模型,建立弓形蟲培養(yǎng)模型不僅可用于篩選新型抗弓形蟲藥物,還可用于抗弓形蟲藥物的作用機(jī)理研究。 研究方法: 弓形蟲速殖子腹腔感染昆明小鼠,建立速殖子體內(nèi)培養(yǎng)模型,并探討了體內(nèi)模型長期傳代保種的方法。將弓形蟲速殖子接種HFF細(xì)胞和HeLa細(xì)胞,建立速殖子體外培養(yǎng)模型,吉姆薩染色鏡下觀察速殖子在細(xì)胞中增殖的速率。建立速殖子HeLa細(xì)胞連續(xù)傳代保種技術(shù),探討溫度和時(shí)間對速殖子產(chǎn)率和活率的影響。 探討胰酶消化法、3μm濾膜過濾法、CF-11纖維素過濾法、Ficoll離心法和Percoll離心法純化體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)模型獲得速殖子的效率。 以速殖子HFF細(xì)胞培養(yǎng)模型為基礎(chǔ),MTT法測定銀杏酸、阿奇霉素和大蒜素對HFF細(xì)胞的安全濃度,MTT法和核素?fù)饺敕ǚ謩e測定銀杏酸、阿奇霉素和大蒜素對蟲體增殖的抑制效果,并探討藥物的作用機(jī)理。吉姆薩染色鏡下連續(xù)觀察銀杏酸和阿奇霉素對速殖子的抑制效果。 以速殖子HeLa細(xì)胞培養(yǎng)模型為基礎(chǔ),MTT法測定銀杏酸對HeLa細(xì)胞的安全濃度,觀察不同濃度銀杏酸對第一代速殖子和第二代速殖子的抑制作用。Real-Time PCR技術(shù)分別測定銀杏酸、阿奇霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星對第一代和第二代速殖子頂質(zhì)體增殖抑制效果。 研究結(jié)果: 速殖子可在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種,每2～3天傳代1次。小鼠腹水中速殖子可在液氮中保存2年以上。RH株速殖子可在HFF細(xì)胞和HeLa細(xì)胞內(nèi)增殖。HFF細(xì)胞接種速殖子后72 h即可被完全破壞,而HeLa細(xì)胞則需要96 h才被完全破壞,速殖子在HFF細(xì)胞內(nèi)增殖速度明顯快于HeLa細(xì)胞。速殖子在HeLa細(xì)胞內(nèi)可進(jìn)行連續(xù)傳代保種,目前已傳至十代以上。蟲體在細(xì)胞內(nèi)增殖速度和傳代時(shí)間穩(wěn)定、形態(tài)良好,未見毒力明顯減弱。在速殖子體外培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),將培養(yǎng)于HeLa細(xì)胞中速殖子首先置于37℃培養(yǎng)72 h,再置于25℃培養(yǎng)120 h后,速殖子的產(chǎn)率達(dá)40倍以上,且活率大于90%,殘留很少量Hela細(xì)胞。 5種純化方法中,以胰酶消化法的速殖子回收率最高,體內(nèi)和體外培養(yǎng)速殖子的回收率分別為109.46%和90.96%。Ficoll離心法的回收率最低,體內(nèi)和體外培養(yǎng)速殖子的回收率分別為0.36%和0.19%。3μm濾膜過濾法和CF-11纖維素過濾法都可以完全清除蟲體懸液中的白細(xì)胞,但對紅細(xì)胞的清除效果不明顯。CF-11纖維素過濾法的回收率高于3μm濾膜;但3μm濾膜過濾法方便快捷。Ficoll離心法對紅細(xì)胞清除效果較好,但蟲體回收率很低;而Percoll離心法蟲體回收率較高,但對紅細(xì)胞的清除效果不理想。 MTT法和核素?fù)饺敕y定銀杏酸、阿奇霉素和大蒜素的體外抗弓形蟲效果顯示,銀杏酸的抗蟲效果與阿奇霉素相近,銀杏酸對HFF細(xì)胞毒性略低于阿奇霉素。通過吉姆薩染色觀察到銀杏酸和阿奇霉素均可在8 h內(nèi)完全清除HFF細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)的速殖子。核素?fù)饺敕ńY(jié)果表明,銀杏酸和阿奇霉素的抗蟲機(jī)理在于抑制速殖子DNA和蛋白質(zhì)的合成。 以Real-Time PCR研究銀杏酸、阿奇霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星對第一代和第二代速殖子頂質(zhì)體增殖的特異性抑制作用。結(jié)果表明:經(jīng)阿奇霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星處理后的第二代速殖子項(xiàng)質(zhì)體數(shù)量較同代的未用藥處理組明顯降低,但藥物處理后第一代蟲體與未處理蟲體頂質(zhì)體數(shù)量無顯著性差異。經(jīng)銀杏酸處理后的第一代與第二代速殖子頂質(zhì)體與同代的用藥處理組之間無明顯差異,銀杏酸無特異性抑制頂質(zhì)增殖能力;但經(jīng)銀杏酸處理后的兩代速殖子核基因組拷貝數(shù)較相應(yīng)的未處理組顯著降低。 結(jié)論: 弓形蟲速殖子體內(nèi)培養(yǎng)模型操作簡單,蟲體增殖率高,但代價(jià)高昂,液氮保種可作為動(dòng)物保種的補(bǔ)充。體外培養(yǎng)模型也能獲得增殖的速殖子,還可用于速殖子連續(xù)傳代保種。體外培養(yǎng)模型實(shí)驗(yàn)成本比體內(nèi)培養(yǎng)模型低,體外培養(yǎng)模型更適用于抗弓形蟲藥物的篩選和藥物作用機(jī)理的研究。 胰酶消化法、3μm濾膜過濾法、CF-11纖維素過濾法、Ficoll離心法和Percoll離心法均可用于體內(nèi)、體外培養(yǎng)模型速殖子的純化,不同純化方法影響速殖子的回收率和純度,根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要,選擇合適的速殖子純化方法。 MTT法和核素?fù)饺敕ǘ伎捎糜跍y定藥物體外抗速殖子增殖效果。MTT法操作簡單,可以迅速得到結(jié)果,但其結(jié)果不精確,可用于新型藥物的初篩。核素?fù)饺敕`敏度高,結(jié)果精確,是目前國內(nèi)外篩選藥物殺蟲效果的首選方法,但會(huì)造成環(huán)境的放射性污染。 Real-Time PCR技術(shù)可測定藥物對弓形蟲速殖子頂質(zhì)體增殖抑制作用,較定量Southern blots方法更為簡單實(shí)用,可用于篩選特異性抗頂質(zhì)體藥物。 銀杏酸體外對速殖子的抑制作用與阿奇霉素相近,是一種有發(fā)展?jié)摿Φ目构蜗x藥物。其抗弓形蟲速殖子增殖的機(jī)理在于抑制核基因組DNA的合成,導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻,從而導(dǎo)致蟲體死亡。阿奇霉素既可抑制頂質(zhì)體的增殖,又可抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成;克林霉素和環(huán)丙沙星抗弓形蟲機(jī)理是特異性地抑制頂質(zhì)體增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R382.5;R285.5

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 葉強(qiáng);張德林;;弓形蟲排泄分泌抗原研究的新進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2012年07期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 曾艷波;急性弓形蟲小鼠感染模型的建立與抗動(dòng)物弓形蟲病藥物的初步篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

2 沈海英;弓形蟲速殖子DNA提取及LAMP檢測弓形蟲的初步研究[D];蘇州大學(xué);2010年

3 王鳳陽;弓形蟲改良凝集試驗(yàn)的建立及我國部分地區(qū)犬、雞弓形蟲病流行病學(xué)調(diào)查[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：2322317