【摘要】： 目的:高效表達重組人IL-31,從而制備IL-31抗體(多克隆抗體/單克隆抗體),探討IL-31抗體拮抗皮膚炎癥的作用,為研發(fā)IL-31抗體治療性新藥打下基礎(chǔ)。方法:(1)培養(yǎng)工程菌株E.coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達,離心收集菌體并超聲破碎,用鎳NTA瓊脂糖凝膠柱純化重組蛋白,定量后分裝備用。(2)重組人IL-31蛋白溶液加等體積的佐劑完全乳化后免疫家兔,制備兔抗人IL-31多克隆抗體。并且經(jīng)ELISA和Western Blot進行鑒定。(3)將IL-31多克隆抗體分為三個劑量10μg、20μg、40μg經(jīng)皮下注射和受損皮膚直接涂抹的途徑,對已經(jīng)致皮膚炎癥的Balb/c小鼠治療7天,同時設(shè)置陰性對照組(未治療組)和空白對照組,治療后3天取治療部位皮膚作石蠟切片進行HE染色觀察組織學(xué)變化,同時定量檢測小鼠血清中IL-6,IL-8,L選擇素和MIP-3β等炎性細胞因子的變化。(4)分析并合成IL-31的優(yōu)勢抗原表位,合成多肽后與牛血清蛋白交聯(lián),免疫小鼠以制備單克隆抗體。采用Protein A親和層析法純化抗體,并且經(jīng)ELISA和Western Blot進行鑒定。結(jié)果:(1)SDS-PAGE電泳證實獲得了高純度的純化人IL-31蛋白。(2)用重組人IL-31蛋白疫苗免疫健康家兔,誘導(dǎo)出高滴度的特異性抗體,在免疫后4周達到高峰,5～6周穩(wěn)定在高水平。采用鹽析法初步純化抗體,并且經(jīng)間接ELISA法檢測后的兔血清抗體效價為1:15000～1:20000,雙向瓊脂擴散效價為1:16。通過Western blot結(jié)果證明重組人IL-31蛋白能與抗IL-31多克隆抗體特異性結(jié)合。(3)小鼠皮膚組織切片HE染色顯示,治療組皮下和皮內(nèi)均有炎癥細胞浸潤,并且呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性趨勢,與陰性對照組比較,炎癥細胞的浸潤明顯減少。(4)小鼠血清中炎性因子ELISA檢測顯示,涂抹組和注射組小鼠血清中IL-6、IL-8均明顯低于陰性對照組(P＜0.05)。同一劑量進行兩兩比較,發(fā)現(xiàn)兩種用藥途徑之間沒有顯著差異。涂抹組和注射組小鼠血清中L選擇素均明顯低于陰性對照組,高于空白對照組。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,注射組與陰性對照組無顯著性差異(p＞0.05)。涂抹組和注射組小鼠血清中MIP-3β平均值明顯低于陰性對照組(p＜0.05)。治療組同一劑量進行兩兩比較,發(fā)現(xiàn)兩種用藥途徑之間沒有顯著差異。(5)通過間接ELISA法檢測兩株雜交瘤細胞誘生的腹水抗體效價分別為1:10000(8A1株)和1:20000(8C3株)。通過Western Blot檢測兔血清抗體和兩株雜交瘤細胞分泌的抗體均與重組人IL-31蛋白特異性結(jié)合。通過間接ELISA法檢測抗體亞型為IgG3。結(jié)論:(1)獲得高效穩(wěn)定表達的重組人IL-31蛋白,以此作為免疫原免疫家兔,獲得到了效價較高的兔抗人IL-31多克隆抗體。(2)兔抗人IL-31多克隆抗體,使皮膚致炎的炎性細胞減少,使小鼠血清中炎癥相關(guān)細胞因子明顯降低,提示IL-31與特應(yīng)性皮炎等皮膚炎癥的發(fā)病機制有關(guān),人IL-31多克隆抗體具有拮抗作用,本研究為IL-31多克隆抗體治療皮膚炎癥提供了依據(jù)。(3)篩選到兩株雜交瘤細胞株,獲得了特異性強、效價高的單克隆抗體,為后續(xù)IL-31的檢測、生物學(xué)功能的研究和IL-31抗體藥物的研發(fā)打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392.7

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本文編號：2322298