【摘要】： 背景與目的 已有許多文獻(xiàn)報(bào)道骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在一定的體外條件下能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。然而目前用以誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)劑很少被應(yīng)用于臨床。研究者們對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響和作用機(jī)制還了解甚少。本實(shí)驗(yàn)旨在探索VEGF體外對BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響作用,并確定實(shí)驗(yàn)中VEGF的最佳的誘導(dǎo)濃度。 方法 (1) BMSCs取自6～8周雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)。細(xì)胞傳代至第3代時(shí),流式細(xì)胞分析鑒定BMSCs表面干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45。 (2) BMSCS經(jīng)傳代3次后經(jīng)10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)預(yù)誘導(dǎo)24h。細(xì)胞被隨機(jī)分為5,10,和20ng/mLVEGF處理組和未經(jīng)VEGF處理的對照組。倒置相差顯微鏡(×200)下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 (3)誘導(dǎo)后的第3天和第10天采用免疫組織化學(xué)方法鑒定神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE),分別計(jì)數(shù)每20個(gè)隨機(jī)視野下NSE陽性細(xì)胞總數(shù)。 結(jié)果 (1)培養(yǎng)第3天可見貼壁細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)各異,以圓形為主,少部分細(xì)胞呈三角形、梭形,有粗短突起。原代第7～10天,較多梭形細(xì)胞形成集落生長。傳代培養(yǎng)2～3代后細(xì)胞形態(tài)變得較均一,細(xì)長梭形細(xì)胞較多,呈漩渦樣生長,部分細(xì)胞呈扁平形。 (2)流式細(xì)胞分析結(jié)果示第3代BMSCs細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物CD90(97.5%)陽性,而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD45陰性。 (3)誘導(dǎo)第3天經(jīng)5,10,和20ng/mLVEGF誘導(dǎo)的組別均可觀察到細(xì)胞胞體回縮,呈錐形或圓形,胞體折光性增強(qiáng),伸出較細(xì)長雙或多極突起,并分出次級突起。而對照組則無此類似現(xiàn)象出現(xiàn)。 (4)誘導(dǎo)第10天,經(jīng)10ng/mLVEGF處理的組別NSE陽性細(xì)胞數(shù)最多(P0.05)。誘導(dǎo)第3天和第10天,對照組中NSE陽性細(xì)胞數(shù)均最少(P0.05)。誘導(dǎo)第10天各組NSE陽性細(xì)胞數(shù)目均較第3天增多(P0.05)。 結(jié)論 (1)在一定條件下,大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外可向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。 (2)本實(shí)驗(yàn)中VEGF能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化;與5和20ng/mL相比,10ng/mL為最合適的濃度。 (3)VEGF可能具有應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs體外向神經(jīng)元定向分化和修復(fù)中樞神經(jīng)損傷和神經(jīng)變性疾病的潛能。
[Abstract]:Background and objective many literatures have reported that bone marrow stromal cells (bone marrow stromal cells,BMSCs) can differentiate into neuron-like cells under certain conditions in vitro. However, the inducers used to induce the differentiation of BMSCs into neuron-like cells are rarely used in clinical practice. Little is known about the effects and mechanisms of vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor,VEGF) on the differentiation of BMSCs into neuron-like cells in vitro. The aim of this study was to investigate the effect of VEGF on the differentiation of BMSCs into neuron-like cells in vitro and to determine the optimal concentration of VEGF. Methods (1) BMSCs were taken from Sprague-Dawley rats of male and female at 6 weeks. BMSCs surface stem cell marker CD90 and hematopoietic stem cell marker CD45. were identified by flow cytometry at passage 3. (2) BMSCS was preinduced by 10ng/mL basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor,b-FGF) for 24 h after three passages. Cells were randomly divided into 5 cells treated with 20ng/mLVEGF and those without VEGF. The morphologic changes of cells were observed daily under inverted phase contrast microscope (脳 200). (3) nerve specific enolase (neuron specific enolase,NSE) was identified by immunohistochemical method on the 3rd and 10th day after induction, and the total number of NSE positive cells was counted in every 20 random fields. Results (1) Adhesion cells were observed on the third day of culture. The cells were mainly round and a few were triangular fusiform and had thick short protuberances. On the 7th day of primary culture, more fusiform cells formed colony growth. After 2 ~ 3 passage culture, the morphology of the cells became more homogeneous, the slender fusiform cells were more, and the cells grew like whirlpool, and some of the cells were flattened. (2) flow cytometry showed that the surface stem cell marker CD90 (97.5%) was positive in the third passage of BMSCs cells, but the hematopoietic stem cell marker CD45 was negative. (3) on the 3rd day of induction, the cell bodies were retracted in the group induced by 20ng/mLVEGF and 5 days after induction. The cell bodies were cone-shaped or circular, the refraction of the cells was enhanced, the elongated or multipolar protuberances were extended, and secondary protrusions were also observed. In the control group, there was no similar phenomenon. (4) on the 10th day of induction, the number of NSE positive cells in the group treated with 10ng/mLVEGF was the highest (P0.05). On the 3rd and 10th day, the number of NSE positive cells in the control group was the least (P0.05). On the 10th day, the number of NSE positive cells in each group was higher than that on the third day (P0.05). Conclusion (1) under certain conditions, rat bone marrow stromal cells can differentiate into neuron-like cells in vitro. (2) VEGF could promote the differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells in vitro, and 10ng/mL was the most suitable concentration compared with 5 and 20ng/mL. (3) VEGF may have the potential to induce BMSCs to differentiate into neurons in vitro and repair central nervous injury and neurodegenerative diseases.
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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本文編號：2320492