【摘要】：登革熱(dengue fever, DF、登革出血熱(dengue haemorrhagic fever,DHF)和登革休克綜合癥(dengue shock syndrome, DSS)是由登革病毒(Dengue virus, DENV)引起的蟲媒傳染病。DENV分為4個(gè)血清型：DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ、 DENV-Ⅲ和DENV-Ⅳ.該病主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播,流行于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)。WHO估計(jì)全球每年有約發(fā)生5000萬到1億例登革熱,其中超過25000人死于該疾病,特別是在亞洲、太平洋群島及中、南美洲許多國家都已構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。目前,仍然沒有有效的抗登革病毒藥物和登革病毒疫苗用于臨床。因此登革熱已經(jīng)成為了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。 登革病毒是有包膜的單股正鏈RNA病毒,由11000個(gè)核苷酸組成。其基因組編碼成一個(gè)多肽鏈后,在宿主的信號(hào)肽酶及病毒編碼的蛋白酶(NS3)作用下,裂解成3種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白及其前體M/prM、包膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。在黃病毒屬蛋白酶作用其自身編碼的多聚蛋白底物的過程中,非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)扮演相當(dāng)重要的角色。 登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是DENV的第二大非結(jié)構(gòu)蛋白,基因全長(zhǎng)1854bp,編碼618個(gè)氨基酸。NS3是一種分子量為大約69KDa的親水性的多功能蛋白,具有蛋白酶、RNA解旋酶和RNA聚合酶多重活性,在病毒的復(fù)制和成熟過程中起著重要的作用。 通過生物信息學(xué)分析,NS3蛋白是亞細(xì)胞內(nèi)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個(gè)膜外蛋白。NS3蛋白含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,N末端的180個(gè)氨基酸為絲氨酸蛋白酶區(qū)域,其中最少需要N端167個(gè)氨基酸才能發(fā)揮絲氨酸蛋白酶的活性；C末端的438個(gè)氨基酸含有另外三種酶結(jié)構(gòu),即RNA解旋酶和NTPase和5'RNA三磷酸酶的活性,參與病毒前體的加工和病毒RNA的復(fù)制及基因組RNA的5端加帽,即調(diào)節(jié)核酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。雖然解旋酶在病毒的生命周期中尚不清楚其具體的作用,但是一般認(rèn)為在病毒利用自身酶聚合時(shí),解旋酶是暫時(shí)分離中間體dsRNA。這種分離機(jī)制將更易于病毒的幾輪的復(fù)制。另外,解旋酶還可能打亂二級(jí)結(jié)構(gòu)形成ssRNA模板或取代宿主其他病毒蛋白結(jié)合到dsRNA,更易于病毒RNA的復(fù)制。NS3的RNA5’三磷酸酶活性可能與病毒基因組的5’加帽反應(yīng)有關(guān),因?yàn)榧用钡牡谝徊椒磻?yīng)是RNA5’端的磷酸集團(tuán)的水解,Bartelma等人首先證實(shí)了登革病毒NS3的RNA5’三磷酸酶的活性。并有文獻(xiàn)報(bào)道NS3蛋白具有良好的免疫原性,存在特異性的CD4+和CD8+識(shí)別表位,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生B、T細(xì)胞應(yīng)答且可在NS2B激活蛋白酶的輔助下,促使NS3與膜的融合,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 目前,通過設(shè)計(jì)特異性酶抑制劑作為治療病毒疾病的藥物,是一種抗病毒的新策略,在與登革病毒同屬一個(gè)家族的HCV就已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,已經(jīng)有HCV的NS3抑制劑類藥物處于臨床試驗(yàn)階段。鑒于NS3同時(shí)具有病毒復(fù)制所必需的多種酶活性及其良好的免疫原性,且已有研究表明,NS3蛋白在不同血清型的登革病毒及黃病毒中相對(duì)保守,能在病人和受試者體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)反應(yīng),故使得登革病毒NS3成為具有潛力的靶分子。 為進(jìn)一步研究NS3蛋白在登革病毒感染中的作用及作為檢測(cè)靶抗原的可能性,本課題構(gòu)建NS3蛋白的原核及真核表達(dá)載體,通過克隆,表達(dá)及純化,探討NS3蛋白對(duì)登革Ⅱ型病毒復(fù)制的影響,為深入闡明登革病毒的致病機(jī)理提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為進(jìn)一步設(shè)計(jì)抗病毒感染的疫苗開發(fā)提供新的思路。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下：一、登革病毒NS3蛋白的生物信息學(xué)分析1.利用生物信息學(xué)軟件,對(duì)黃病毒屬不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)的NS3蛋白及其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,NS3蛋白在不同的血清型及黃病毒屬中存在保守序列；通過構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),登革Ⅱ型NS3蛋白與登革Ⅳ型親緣關(guān)系比較近,與黃病毒屬中的日本腦炎病毒及西尼河病毒的親緣關(guān)系較近。 2. Rare Codon Calcμlator分析,編碼登革Ⅱ型病毒NS3蛋白的序列中存在稀有密碼子；預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)位于膜外,不存在跨膜區(qū)域；Virus-mPLoc^測(cè)此蛋白定位于病毒衣殼與宿主的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 二、DENV-Ⅱ-NS3蛋白的原核表達(dá)、鑒定及免疫反應(yīng)性的初探 1.NS3的原核表達(dá)及重組蛋白的親和純化 從乳鼠腦內(nèi)提取登革Ⅱ型的病毒液,設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR以DENV-Ⅱ-mRNA為模板擴(kuò)增出DENV-Ⅱ-NS3編碼基因NS3。將NS3全長(zhǎng)基因連接到pMD18-T載體,通過菌落篩選,酶切及測(cè)序鑒定,挑選陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-DENV-II-NS3。以pMD18-T-DENV-II-NS3質(zhì)粒為模板,通過PCR擴(kuò)增出DENV-Ⅱ-NS3。將NS3全長(zhǎng)基因插入原核表達(dá)載體pET32a,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得的pET32a-NS3/BL21(DE3)陽性菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,超聲裂解提取表達(dá)產(chǎn)物,融合蛋白NS3主要以包涵體的形式存在。包涵體裂解液(?)Ni-NTA親和純化后,獲得預(yù)期大小的特異性的目標(biāo)蛋白條帶。用Histag單抗及登革病毒NS3多抗,經(jīng)Western blo證實(shí)為所需目的蛋白,并說明DENV-Ⅱ-NS3蛋白具有一定的免疫反應(yīng)性。NS3蛋白的純化及蛋白競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)的分析為抗進(jìn)一步研究NS3蛋白在登革病毒感染機(jī)制中的作用奠定了良好的工作基礎(chǔ)。 2.DENV-Ⅱ-NS3純化蛋白的生物學(xué)功能 經(jīng)免疫印跡檢測(cè),DENV-Ⅱ-NS3蛋白具有一定的免疫反應(yīng)性；利用BHK-21細(xì)胞繁殖登革Ⅱ型病毒,純化病毒后并采用TCIDso方法測(cè)定收集的病毒液滴度測(cè)定滴度；純化后的登革Ⅱ型病毒NS3純蛋白及定量的登革Ⅱ病毒液混合后攻擊BHK-21細(xì)胞,通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制分析,采用MTT檢測(cè)宿主細(xì)胞的活力說明在一定的劑量范圍內(nèi),隨著純化蛋白的量的增加,細(xì)胞的活力就越好。結(jié)果顯示,原核表達(dá)的NS3重組蛋白能夠在一定程度上抑制登革病毒感染宿主細(xì)胞。 三、DENV-II-NS3蛋白在真核表達(dá)載體的克隆、表達(dá)及其功能性初步探索 1.真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-NS3P、 pcDNA-NS3H和pcDNA-NS3的構(gòu)建 以pMD18-T-DENV-II-NS3質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,通過PCR擴(kuò)增出DENVII-NS3及其結(jié)構(gòu)域NS3P及NS3H編碼基因。根據(jù)合適的多克隆位點(diǎn)分別將克隆好的三段目的基因插入真核表達(dá)載體pcDNA(+),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,獲得pcDNA-NS3P/DH5α、pcDNA-NS3H/DH5aα和pcDNA-NS3/DH5a陽性菌。使用去內(nèi)毒素試劑盒超純提取質(zhì)粒pcDNA-NS3P、pcDNA-NS3H、pcDNA-NS3及pcDNA (+)的DNA后,利用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞BHK-21細(xì)胞,采用半定量PCR及間接免疫熒光染色顯示NS3蛋白及其結(jié)構(gòu)域蛋白酶及解旋酶的表達(dá),三種質(zhì)粒分別命名為：pcDNA-NS3P、pcDNA-NS3H和pcDNA-NS3. 2.DENV-II-NS3蛋白具有抑制病毒復(fù)制的作用 經(jīng)大規(guī)模超純提取質(zhì)粒pcDNA-NS3P、pcDNA-NS3H、pcDNA-NS3和pcDNA(+)的DNA后,利用lip2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞6h后,使用MOI=1的純化后的登革Ⅱ型病毒攻擊BHK-21細(xì)胞,72h后收集細(xì)胞的總RNA,應(yīng)用q-RTPCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)病毒載量的變化。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcNS3、pcNS3H組均與空白對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組間的病毒載量存在著差異(p0.05),空白對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染pcNS3P組雖與未轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組間有量的變化,但之間的差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。因此證實(shí)：重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的NS3蛋白及其結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞水平上能夠影響登革Ⅱ型病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。 本研究分別用原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載構(gòu)建的NS3重組質(zhì)粒,均從細(xì)胞水平證實(shí)登革Ⅱ型病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3(NS3)對(duì)于病毒的復(fù)制具有一定的抑制作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373;R3416

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2315821