【摘要】： 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病的病原體。從世界范圍來看,結(jié)核病仍是一種發(fā)病率和死亡率極高的傳染性疾病,全球人口的三分之一感染了結(jié)核分枝桿菌,而且,其發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。其主要原因之一是由于耐多藥(multi drug resistant, MDR)甚至是廣泛耐藥(extensive drug resistant, XDR)結(jié)核桿菌的出現(xiàn),許多一線甚至一些二線抗結(jié)核藥物都無法有效治療結(jié)核病。因此,當(dāng)前的首要任務(wù)是從結(jié)核分枝桿菌自身尋找新的靶點(diǎn),以此來研發(fā)新的抗結(jié)核藥物。 分枝桿菌細(xì)胞壁的核心結(jié)構(gòu)由分枝菌酸,聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖構(gòu)成。其中,肽聚糖是維持細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)和滲透壓平衡的機(jī)構(gòu)基礎(chǔ),其組成及結(jié)構(gòu)可能與G-細(xì)菌肽聚糖相似,即由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替連接形成的多糖鏈與短肽鏈交叉連接形成網(wǎng)狀大分子機(jī)構(gòu)。UDP-乙酰胞壁酸是N-乙酰胞壁酸的糖基供體,兩個(gè)酶催化由UDP-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)變?yōu)閁DP-乙酰胞壁酸的代謝途徑。MurA (UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶)是催化此條途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶,由于此反應(yīng)途徑無代謝旁路,并且在哺乳動(dòng)物中不存在此代謝途徑,因此,催化此代謝途徑的酶可能是抗結(jié)核藥物的作用靶點(diǎn)。 為了建立體外篩選抗結(jié)核藥物的分子模型,我們首先要克隆編碼結(jié)核分枝桿菌UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶的murA基因,然后表達(dá)Tb MurA蛋白,為進(jìn)一步研究UDP-N-乙酰葡糖胺1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶的功能及建立篩選抗結(jié)核藥物的酶反應(yīng)體系提供物質(zhì)保障。 本論文的目的：(1)用pET29b表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌MurA蛋白,優(yōu)化表達(dá)條件以期獲得可溶性蛋白；(2)分離、溶解、純化及鑒定包含體形式的Tb MurA蛋白,并用純化的Tb MurA蛋白免疫兔子以制備多克隆抗體,對(duì)抗體的效價(jià)和特異性進(jìn)行檢測；(3)用pVV 16表達(dá)載體在恥垢分枝桿菌mc2155中表達(dá)Tb MurA蛋白,并用親和層析技術(shù)純化Tb MurA蛋白,用SDS-PAGE以及Western blotting鑒定所純化的Tb MurA蛋白；(4)用高效液相色譜(HPLC)法和化學(xué)顯色法兩種方法測定MurA蛋白的酶活性。 本論文獲得的結(jié)果： 1.表達(dá)載體pET29b-Tb murA的構(gòu)建 用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切pMD18-Tb murA質(zhì)粒,回收和純化TbmurA基因,將其連接到pET29b表達(dá)載體的NdeⅠ和HindⅢ位點(diǎn),構(gòu)建pET29b-Tb murA表達(dá)質(zhì)粒。用SmaⅠ酶切的方法鑒定陽性重組質(zhì)粒。MurA蛋白的C端與pET29b表達(dá)載體上的6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白,便于目的蛋白的檢測和純化。 2. Tb MurA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化 將pET29b-Tb murA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,誘導(dǎo)攜帶pET29b-Tb murA質(zhì)粒的BL21(DE3)表達(dá)重組蛋白。用超聲方法破碎誘導(dǎo)后的BL21(DE3),對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析,結(jié)果表明Tb MurA蛋白在BL21(DE3)中形成包含體。優(yōu)化表達(dá)條件,通過降低IPTG的濃度、誘導(dǎo)溫度及與分子伴侶共表達(dá)等,但沒有改善目的蛋白的溶解性。 3.包含體的分離、溶解、純化及鑒定 將包含體進(jìn)行了分離,用溶解緩沖液溶解,獲得了很好的溶解效果,獲得了大量的可溶性蛋白。用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化溶解后的Tb MurA蛋白。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法),SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明我們獲得了純Tb MurA蛋白。 4.多克隆抗體的制備及效價(jià)、特異性檢測 將純化的Tb MurA蛋白溶液制備成免疫用抗原,免疫家兔,制備抗血清,通過間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測得抗血清的抗體滴度為1：78125,采用抗血清及偶聯(lián)堿性磷酸酶的山羊抗兔IgG二抗分別對(duì)在恥垢分枝桿菌中表達(dá)的TbMurA蛋白和野生恥垢分枝桿菌上清蛋白進(jìn)行Western Blotting分析,結(jié)果表明制備的MurA多克隆抗體特異性較好。 5.表達(dá)載體pVV16-Tb murA的構(gòu)建 用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切pMD18-Tb murA質(zhì)粒,回收和純化TbmurA基因,將其連接到pVV1 6表達(dá)載體的NdeⅠ和HindⅢ位點(diǎn),構(gòu)建pVV16-Tb murA表達(dá)質(zhì)粒。用XhoI酶切的方法鑒定陽性重組質(zhì)粒。TbMurA蛋白的C端與pVV1 6表達(dá)載體上的組氨酸標(biāo)簽形成融合蛋白,便于目的蛋白的檢測和純化。 6. Tb MurA蛋白在恥垢分枝桿菌mc2155中的表達(dá) 將pVV16-Tb murA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc21 55感受態(tài)細(xì)胞中,37℃震蕩培養(yǎng)48小時(shí)表達(dá)目的蛋白,用超聲方法破碎培養(yǎng)后的細(xì)菌,對(duì)上清和沉淀組分進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting分析,結(jié)果表明Tb MurA蛋白在mc2155中可溶性表達(dá)。 7.采用親和層析技術(shù)純化Tb MurA蛋白 pVV16表達(dá)載體使重組MurA蛋白C端帶有組氨酸標(biāo)簽,因此,用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化Tb MurA蛋白。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量(考馬斯亮藍(lán)法),SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果表明我們獲得了純Tb MurA蛋白。 8.建立Tb MurA蛋白的酶活性測定方法 (1)高效液相色譜法：采用Nova-Pak C18(3.9×150mm,4μm)色譜柱,以20 mM三乙胺-醋酸緩沖液(pH 4.0)為流動(dòng)相,流速0.5mLmin-1,在波長260nm處檢測反應(yīng)底物UDP-GlcNAc的減少,其洗脫時(shí)間為6.3min。 (2)化學(xué)顯色法：反應(yīng)產(chǎn)物之一為磷酸,磷酸與鉬酸銨形成磷鉬酸復(fù)合物后使孔雀石綠顏色由黃綠變?yōu)樗{(lán)綠,用酶標(biāo)儀在630 nm處檢測吸光值變化,以測定所生成磷酸的含量。 結(jié)論：在本研究中,我們構(gòu)建了pET29b-Tb murA表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出大量以包含體性形式存在的Tb MurA蛋白。 我們用包含體中的Tb MurA蛋白制備了多克隆抗體,分別用ELISA和Western blotting進(jìn)行檢測和鑒定,多克隆抗體有較高的效價(jià)和特異性。 我們構(gòu)建了pVV16-Tb murA表達(dá)載體,在恥垢分枝桿菌mc2155中表達(dá)出以可溶性形式存在的Tb MurA蛋白,并鑒定了Tb MurA蛋白的酶活性。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2314901